Хвароба Альцгеймера (БА) не мае бялковых біямаркераў, якія адлюстроўваюць яе множную патафізіялогію, што перашкаджае прагрэсу дыягностыкі і лячэння. Тут мы выкарыстоўваем комплексную пратэёміку для ідэнтыфікацыі біямаркераў спіннамазгавой вадкасці (ліквора), якія прадстаўляюць шырокі спектр патафізіялогіі AD. Мультыплексная мас-спектраметрыя ідэнтыфікавала каля 3500 і каля 12 000 бялкоў у СМЖ і галаўным мозгу адпаведна. Сеткавы аналіз пратэёма мозгу выявіў 44 модуля біяразнастайнасці, 15 з якіх перакрываліся з пратэомам спіннамазгавой вадкасці. Маркеры AD СМЖ у гэтых модулях, якія перакрываюцца, складаюцца ў пяць бялковых груп, якія прадстаўляюць розныя патафізіялагічныя працэсы. Сінапсы і метабаліты ў галаўным мозгу БА памяншаюцца, але СМЖ павялічваецца, у той час як узбагачаная гліяй миелинизация і імунныя групы ў галаўным мозгу і СМЖ павялічваюцца. Кансістэнцыя і спецыфічнасць панэлі змяненняў былі пацверджаны ў больш чым 500 дадатковых узорах СМЖ. Гэтыя групы таксама вызначылі біялагічныя падгрупы пры бессімптомнай БА. У цэлым, гэтыя вынікі з'яўляюцца перспектыўным крокам на шляху вэб-інструментаў біямаркераў для клінічнага прымянення пры AD.
Хвароба Альцгеймера (БА) з'яўляецца найбольш распаўсюджанай прычынай нейрадэгенератыўнай дэменцыі ва ўсім свеце і характарызуецца шырокім спектрам дысфункцый біялагічнай сістэмы, уключаючы сінаптычную перадачу, апасродкаваны гліяй імунітэт і мітахандрыяльны метабалізм (1-3). Аднак устаноўленыя бялковыя біямаркеры па-ранейшаму сканцэнтраваны на выяўленні амілаіду і тау-бялку і таму не могуць адлюстроўваць гэтую разнастайную патафізіялогію. Гэтыя «асноўныя» бялковыя біямаркеры, якія найбольш надзейна вымяраюцца ў спіннамазгавой вадкасці (СМЖ), уключаюць (i) бета-амилоидный пептыд 1-42 (Aβ1-42), які адлюстроўвае адукацыю корковых амилоидных бляшак; (ii) агульны тау, прыкмета дэгенерацыі аксона; (iii) фасфа-таў (p-таў), прадстаўнік паталагічнага гіперфасфаралявання таў (4-7). Нягледзячы на тое, што гэтыя биомаркеры спіннамазгавой вадкасці значна палегчылі наша выяўленне «пазначаных» бялковых захворванняў AD (4-7), яны ўяўляюць сабой толькі невялікую частку складанай біялогіі, якая стаіць за хваробай.
Адсутнасць патафізіялагічнай разнастайнасці біямаркераў AD прывяла да шматлікіх праблем, у тым ліку (i) немагчымасці ідэнтыфікацыі і колькаснай ацэнкі біялагічнай гетэрагеннасці пацыентаў з AD, (ii) недастатковага вымярэння цяжару і прагрэсавання захворвання, асабліва на даклінічнай стадыі, і (ii) iii) распрацоўка тэрапеўтычных прэпаратаў, якія не змаглі цалкам вырашыць усе аспекты неўралагічнага пагаршэння. Наша апора на знакавую паталогію для апісання AD ад звязаных з ёй захворванняў толькі пагаршае гэтыя праблемы. Усё больш доказаў паказвае, што большасць пажылых людзей з дэменцыяй маюць больш чым адну паталагічную характарыстыку зніжэння кагнітыўных функцый (8). Больш за 90% людзей з паталогіяй AD таксама маюць сасудзістыя захворванні, уключэнні TDP-43 або іншыя дэгенератыўныя захворванні (9). Гэтыя высокія долі паталагічнага перакрыцця парушылі нашу бягучую дыягнастычную аснову дэменцыі, і неабходна больш поўнае патафізіялагічнае вызначэнне захворвання.
У сувязі з тэрміновай патрэбай у розных біямаркерах AD, у гэтай галіне ўсё часцей выкарыстоўваецца метад «omics», заснаваны на агульнай сістэме выяўлення біямаркераў. Паскоранае фармацэўтычнае партнёрства (AMP)-AD Alliance было запушчана ў 2014 годзе і знаходзіцца ў авангардзе праграмы. Гэтыя міждысцыплінарныя намаганні Нацыянальнага інстытута аховы здароўя, навуковых колаў і прамысловасці накіраваны на выкарыстанне сістэмных стратэгій для лепшага вызначэння патафізіялогіі AD і распрацоўкі дыягнастычнага аналізу біяразнастайнасці і стратэгій лячэння (10). У рамках гэтага праекта сеткавая пратэёміка стала перспектыўным інструментам для прасоўвання сістэмных біямаркераў у AD. Гэты аб'ектыўны падыход, арыентаваны на дадзеныя, арганізуе складаныя наборы пратэёмічных дадзеных у групы або «модулі» сумесна экспрэсаваных бялкоў, якія звязаны з пэўнымі тыпамі клетак, арганэл і біялагічнымі функцыямі (11-13). Амаль 12 насычаных інфармацыяй сеткавых пратэёмічных даследаванняў былі праведзены на мозгу AD (13-23). У цэлым гэтыя аналізы паказваюць, што пратэом сеткі мозгу AD падтрымлівае модульную арганізацыю ў незалежных кагортах і некалькіх абласцях кары галаўнога мозгу ў высокай ступені захаванасці. Акрамя таго, некаторыя з гэтых модуляў дэманструюць узнаўляльныя змены ў колькасці, звязанай з AD, у наборах даных, што адлюстроўвае патафізіялогію шматлікіх захворванняў. У сукупнасці гэтыя высновы дэманструюць перспектыўную кропку прывязкі для адкрыцця пратэома сеткі мозгу як сістэмнага біямаркера пры AD.
Каб пераўтварыць сеткавы пратэом AD мозгу ў клінічна карысныя сістэмныя біямаркеры, мы аб'ядналі сетку мозгу з пратэёмным аналізам CSF AD. Гэты інтэграваны падыход прывёў да ідэнтыфікацыі пяці перспектыўных набораў біямаркераў СМЖ, якія звязаны з шырокім спектрам патафізіялогіі галаўнога мозгу, уключаючы сінапсы, крывяносныя пасудзіны, миелинизацию, запаленне і дысфункцыю метабалічных шляхоў. Мы паспяхова праверылі гэтыя панэлі біямаркераў з дапамогай аналізу некалькіх рэплікацый, уключаючы больш за 500 узораў СМЖ ад розных нейрадэгенератыўных захворванняў. Гэтыя валідацыйныя аналізы ўключаюць вывучэнне групавых мішэняў у СМЖ пацыентаў з бессімптомнай БА (AsymAD) або дэманстрацыю прыкмет анамальнага назапашвання амілоіду ў нармальным кагнітыўным асяроддзі. Гэтыя аналізы падкрэсліваюць значную біялагічную гетэрагеннасць папуляцыі AsymAD і ідэнтыфікуюць панэльныя маркеры, якія могуць быць у стане падтыпаваць людзей на самых ранніх стадыях захворвання. У цэлым гэтыя вынікі ўяўляюць сабой ключавы крок у распрацоўцы бялковых биомаркеров, заснаваных на некалькіх сістэмах, якія могуць паспяхова вырашаць многія клінічныя праблемы, з якімі сутыкаецца AD.
Асноўная мэта гэтага даследавання - вызначыць новыя биомаркеры спіннамазгавой вадкасці, якія адлюстроўваюць розныя патафізіялогіі галаўнога мозгу, якія прыводзяць да AD. На малюнку S1 прадстаўлена наша метадалогія даследавання, якая ўключае (i) комплексны аналіз, заснаваны на папярэдніх высновах AD CSF і сеткавага пратэёма мозгу для ідэнтыфікацыі шматлікіх біямаркераў захворванняў CSF, звязаных з галаўным мозгам, і (ii) наступную рэплікацыю. Гэтыя біямаркеры знаходзяцца ў некалькіх незалежных цэрэбраспінальных вадкасці кагорты. Даследаванне, арыентаванае на адкрыццё, пачалося з аналізу дыферэнцыяльнай экспрэсіі СМЖ у 20 кагнітыўна нармальных асоб і 20 пацыентаў з AD у Даследчым цэнтры хваробы Альцгеймера імя Эмары Гойзуэты (ADRC). Дыягназ AD вызначаецца як значнае кагнітыўнае парушэнне пры наяўнасці нізкага Aβ1-42 і павышаных узроўняў агульнага тау і р-тау ў спіннамазгавой вадкасці [Сярэдняя Манрэальская кагнітыўная ацэнка (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (табліца S1A). Кантроль (сярэдні MoCA, 26,7 ± 2,2) меў нармальныя ўзроўні биомаркеров СМЖ.
СМЖ чалавека характарызуецца дынамічным дыяпазонам утрымання бялку, у якім альбумін і іншыя надзвычай багатыя вавёркі могуць перашкодзіць выяўленню цікавых бялкоў (24). Каб павялічыць глыбіню адкрыцця бялкоў, мы выдалілі першыя 14 вельмі багатых бялкоў з кожнага ўзору СМЖ перад аналізам мас-спектраметрыі (МС) (24). У агульнай складанасці 39 805 пептыдаў былі ідэнтыфікаваны з дапамогай МС, якія былі адлюстраваны ў 3691 пратэёмах у 40 узорах. Колькасная ацэнка бялку ажыццяўляецца з дапамогай множнай тандэмнай маркіроўкі масы (TMT) (18, 25). Для таго, каб ліквідаваць адсутныя дадзеныя, мы ўключылі толькі тыя вавёркі, якія былі колькасна вызначаны па меншай меры ў 50% узораў у наступным аналізе, такім чынам, канчаткова вызначыўшы колькасна 2875 пратэёмаў. З-за значнай розніцы ва ўсіх узроўнях агульнай колькасці бялку кантрольны ўзор лічыўся статыстычна выкідам (13) і не быў уключаны ў наступны аналіз. Значэнні колькасці астатніх 39 узораў былі скарэкціраваны ў залежнасці ад узросту, полу і каварыяцыі партыі (13-15, 17, 18, 20, 26).
Выкарыстоўваючы статыстычны аналіз t-тэсту для ацэнкі дыферэнцыяльнай экспрэсіі ў наборы дадзеных рэгрэсіі, гэты аналіз вызначыў вавёркі, узровень колькасці якіх быў значна зменены (P <0,05) паміж кантрольнай групай і выпадкамі AD (табліца S2A). Як паказана на малюнку 1A, колькасць у агульнай складанасці 225 бялкоў у AD значна знізілася, а колькасць 303 бялкоў значна павялічылася. Гэтыя вавёркі з дыферэнцыяльнай экспрэсіяй уключаюць некалькі раней ідэнтыфікаваных маркераў AD спіннамазгавой вадкасці, такіх як бялок tau, звязаны з мікратрубачкамі (MAPT; P = 3,52 × 10-8), нейрафіламент (NEFL; P = 6,56 × 10-3), звязаны з ростам бялок 43 (GAP43; P = 1,46 × 10-5), бялок, які звязвае тоўстыя кіслоты 3 (FABP3; P = 2,00 × 10-5), хітыназа 3, як 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10-6), нервовы гранулін (NRGN; P = 3,43 × 10-4) і VGF фактару росту нерваў (VGF; P = 4,83 × 10-3) (4-6). Тым не менш, мы таксама вызначылі іншыя вельмі важныя мэты, такія як інгібітар дысацыяцыі GDP 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) і звязанае з SPARC модульнае звязванне кальцыя 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). Аналіз геннай анталогіі (GO) 225 значна паменшаных бялкоў выявіў цесную сувязь з працэсамі вадкасці ў арганізме, такімі як метабалізм стэроідаў, згусальнасць крыві і гарманальная актыўнасць (малюнак 1B і табліца S2B). Наадварот, значнае павелічэнне бялку 303 цесна звязана са структурай клетак і энергетычным абменам.
(A) Графік вулкана паказвае змяненне кратнасці log2 (вось X) адносна статыстычнага значэння P -log10 (вось Y), атрыманага з дапамогай t-тэсту, які выкарыстоўваецца для выяўлення дыферэнцыяльнай экспрэсіі паміж кантролем (CT) і AD выпадкі CSF пратэёма ўсіх бялкоў. Вавёркі са значна паніжаным узроўнем (P <0,05) пры AD паказаны сінім колерам, у той час як вавёркі са значна павышаным узроўнем пры захворванні паказаны чырвоным. Абраны бялок маркіруецца. (B) Верхнія тэрміны GO, звязаныя з бялком, значна зніжаны (сіні) і павышаны (чырвоны) пры AD. Паказвае тры тэрміны GO з самымі высокімі z-баламі ў галіне біялагічных працэсаў, малекулярных функцый і клеткавых кампанентаў. (C) Вымераны MS узровень MAPT ва ўзоры СМЖ (злева) і яго карэляцыя з узроўнем tau ўзору ELISA (справа). Адлюстроўваецца каэфіцыент карэляцыі Пірсана з адпаведным значэннем P. З-за адсутнасці дадзеных ELISA для аднаго выпадку AD гэтыя лічбы ўключаюць значэнні для 38 з 39 прааналізаваных выпадкаў. (D) Кантраляваны кластарны аналіз (P <0,0001, Бенджаміні-Хохберг (BH) скарэкціраваны P <0,01) на кантрольных і AD CSF знойдзеных узораў з выкарыстаннем 65 найбольш значна змененых бялкоў у наборы дадзеных. Стандартызаваць, унармаваць.
Пратэёмны ўзровень MAPT цесна звязаны з незалежна вымераным узроўнем тау ELISA (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; малюнак 1C), што пацвярджае сапраўднасць нашага вымярэння MS. Пасля пераварвання трыпсінаў на ўзроўні бялку-папярэдніка амилоида (АРР), ізаформа-спецыфічныя пептыды, адлюстраваныя на С-канцы Aβ1-40 і Aβ1-42, не могуць быць эфектыўна іянізаваны (27, 28). Такім чынам, пептыды APP, якія мы ідэнтыфікавалі, не маюць нічога агульнага з узроўнямі ELISA Aβ1-42. Для таго, каб ацаніць дыферэнцыяльную экспрэсію ў кожным выпадку, мы выкарыстоўвалі дыферэнцыяльна экспрэсіраваныя вавёркі з P <0,0001 [частата ілжывых адкрыццяў (FDR) з папраўкай на P <0,01] для выканання кантраляванага кластарнага аналізу узораў (табліца S2A). Як паказана на малюнку 1D, гэтыя 65 вельмі значных бялкоў могуць правільна групаваць узоры ў залежнасці ад стану захворвання, за выключэннем аднаго выпадку AD з характарыстыкамі, падобнымі да кантролю. З гэтых 65 бялкоў 63 павялічваліся пры AD, у той час як толькі два (CD74 і ISLR) зніжаліся. У агульнай складанасці гэтыя аналізы спіннамазгавой вадкасці выявілі сотні бялкоў у AD, якія могуць служыць біямаркерамі захворвання.
Затым мы правялі незалежны сеткавы аналіз протеома мозгу AD. Кагорта мозгу гэтага адкрыцця ўключала дорсолатеральную префронтальную кару (DLPFC) з кантрольных (n = 10), хвароба Паркінсана (PD; n = 10), змешаны AD/PD (n = 10) і AD (n = 10) выпадкі. ) Узор. Эмеры Гойзуэта ADRC. Дэмаграфічныя дадзеныя гэтых 40 выпадкаў былі апісаны раней (25) і зведзены ў табліцы S1B. Мы выкарыстоўвалі TMT-MS для аналізу гэтых 40 тканін мозгу і кагорты рэплікацыі з 27 выпадкаў. У агульнай складанасці гэтыя два наборы дадзеных мозгу далі 227 121 унікальных пептыдаў, якія былі адлюстраваны ў 12 943 пратэомах (25). Толькі тыя вавёркі, якія былі колькасна вызначаны па меншай меры ў 50% выпадкаў, былі ўключаны ў наступныя даследаванні. Канчатковы набор дадзеных аб адкрыцці змяшчае 8817 бялкоў, якія вызначаюцца колькасна. Адрэгулюйце ўзровень бялку ў залежнасці ад узросту, полу і пасмяротнага інтэрвалу (PMI). Аналіз дыферэнцыяльнай экспрэсіі набору дадзеных пасля рэгрэсіі паказаў, што ўзровень бялку> 2000 быў значна зменены [P <0,05, дысперсійны аналіз (ANOVA)] у дзвюх і больш кагортах захворванняў. Затым мы правялі кантраляваны кластарны аналіз на аснове дыферэнцыраванай экспрэсіі бялкоў і P <0,0001 у параўнанні AD/кантролю і/або AD/PD (малюнак S2, A і B, табліца S2C). Гэтыя 165 моцна змененых бялкоў выразна адлюстроўваюць выпадкі паталогіі AD з кантрольных і PD узораў, пацвярджаючы моцныя спецыфічныя для AD змены ва ўсім протеоме.
Затым мы выкарысталі алгарытм пад назвай Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) для выканання сеткавага аналізу выяўленага пратэёма мозгу, які арганізуе набор дадзеных у бялковыя модулі з аналагічнымі мадэлямі экспрэсіі (11-13). Аналіз ідэнтыфікаваў 44 модуля (М) сумесна экспрэсіраваных бялкоў, адсартаваных і пранумараваных ад самага вялікага (M1, n = 1821 бялок) да самага маленькага (M44, n = 34 бялку) (малюнак 2A і табліца S2D) . Як згадвалася вышэй (13) Разлічыце рэпрэзентатыўны профіль экспрэсіі або характэрны бялок кожнага модуля і суаднясіце яго са станам хваробы і паталогіяй AD, гэта значыць усталюйце альянс рэестра хваробы Альцгеймера (CERAD) і ацэнкі Braak (малюнак 2B). У цэлым 17 модуляў былі істотна звязаны з неўрапаталогіяй AD (P <0,05). Многія з гэтых модуляў, звязаных з хваробай, таксама багатыя клеткавымі тыпаспецыфічнымі маркерамі (малюнак 2B). Як згадвалася вышэй (13), ўзбагачэнне тыпу клетак вызначаецца шляхам аналізу перакрыцця модуляў і спісу спасылак генаў, спецыфічных для тыпу клетак. Гэтыя гены атрыманы з апублікаваных дадзеных у ізаляваных нейронах мышэй, эндотелиальных і глиальных клетках. Эксперымент секвенирования РНК (RNA-seq) (29).
(A) Адкрыйце для сябе WGCNA пратэёма мозгу. (B) Двухвагавая сярэдняя карэляцыя (BiCor) аналіз модульнага сігнатурнага бялку (першага асноўнага кампанента модульнай экспрэсіі бялку) з неўрапаталагічнымі характарыстыкамі AD (уверсе), у тым ліку баламі CERAD (Aβ бляшкі) і Braak (тау клубкі). Інтэнсіўнасць станоўчай (чырвоны) і адмоўнай (сіні) карэляцыі паказаны двухколернай цеплавой картай, а зорачкі паказваюць на статыстычную значнасць (P <0,05). Выкарыстоўвайце гіпергеаметрычны дакладны тэст Фішэра (FET) (унізе), каб ацаніць сувязь тыпу клетак кожнага бялковага модуля. Інтэнсіўнасць чырвонага зацянення паказвае ступень ўзбагачэння тыпу клетак, а зорачка паказвае статыстычную значнасць (Р <0,05). Выкарыстоўвайце метад BH, каб выправіць значэнне P, атрыманае з FET. (C) GO аналіз модульных бялкоў. Найбольш цесна звязаныя біялагічныя працэсы паказаны для кожнага модуля або адпаведнай групы модуляў. аліга, алігадэндрацыт.
Набор з пяці цесна звязаных модуляў, багатых астрацытамі і мікрагліяй (M30, M29, M18, M24 і M5), паказаў моцную станоўчую карэляцыю з неўрапаталогіяй AD (малюнак 2B). Анталагічны аналіз звязвае гэтыя гліальныя модулі з клеткавым ростам, праліферацыяй і імунітэтам (малюнак 2C і табліца S2E). Два дадатковых глиальных модуля, M8 і M22, таксама моцна павышаюцца пры захворванні. M8 цесна звязаны з Toll-падобным рэцэптарным шляхам, сігнальным каскадам, які гуляе ключавую ролю ў прыроджаным імунным адказе (30). У той жа час М22 цесна звязаны з посттрансляцыйнай мадыфікацыяй. M2, які багаты алігадэндрацытамі, паказвае моцную станоўчую карэляцыю з паталогіяй AD і анталагічную сувязь з сінтэзам нуклеазідаў і рэплікацыяй ДНК, што паказвае на ўзмоцненую праліферацыю клетак пры захворваннях. У цэлым, гэтыя высновы пацвярджаюць павышэнне глиальных модуляў, якія мы раней назіралі ў протеоме сеткі AD (13, 17). У цяперашні час выяўлена, што многія звязаныя з БА гліяльныя модулі ў сетцы дэманструюць больш нізкія ўзроўні экспрэсіі ў кантрольных выпадках і выпадках БП, што падкрэслівае іх спецыфічнасць захворвання, якая павышана пры БА (малюнак S2C).
Толькі чатыры модуля ў нашым сеткавым протеоме (M1, M3, M10 і M32) цесна адмоўна карэлююць з паталогіяй AD (P <0,05) (мал. 2, B і C). І M1, і M3 багатыя нейрональнымі маркерамі. M1 цесна звязаны з сінаптычнымі сігналамі, у той час як M3 цесна звязаны з функцыяй мітахондрый. Няма доказаў узбагачэння тыпу клетак для M10 і M32. M32 адлюстроўвае сувязь паміж M3 і метабалізмам клетак, у той час як M10 моцна звязаны з ростам клетак і функцыяй мікратрубачак. У параўнанні з AD ва ўсіх чатырох модулях узмоцнены кантроль і PD, што дае ім змены AD, характэрныя для захворвання (малюнак S2C). У цэлым, гэтыя вынікі пацвярджаюць зніжэнне колькасці багатых нейронамі модуляў, якія мы раней назіралі ў AD (13, 17). Такім чынам, сеткавы аналіз пратэёма мозгу, які мы выявілі, вырабіў спецыяльна змененыя модулі AD, якія адпавядаюць нашым папярэднім высновам.
AD характарызуецца ранняй бессімптомнай стадыяй (AsymAD), у якой у людзей назіраецца назапашванне амілоіду без клінічнага зніжэння кагнітыўных здольнасцей (5, 31). Гэтая бессімптомная стадыя ўяўляе сабой крытычнае акно для ранняга выяўлення і ўмяшання. Раней мы прадэманстравалі моцнае модульнае захаванне протеома сеткі мозгу AsymAD і AD у незалежных наборах дадзеных (13, 17). Для таго, каб пераканацца, што мазгавая сетка, якую мы зараз выявілі, адпавядае гэтым папярэднім высновам, мы прааналізавалі захаванасць 44 модуляў у рэплікаваным наборы даных з 27 арганізацый DLPFC. Гэтыя арганізацыі ўключаюць кантроль (n = 10), AsymAD (n = 8) і AD (n = 9) выпадкі. Узоры кантролю і AD былі ўключаны ў аналіз нашай кагорты мозгу адкрыцця (табліца S1B), у той час як выпадкі AsymAD былі унікальнымі толькі ў кагорце рэплікацыі. Гэтыя выпадкі AsymAD таксама паступілі з банка мозгу Emory Goizueta ADRC. Нягледзячы на тое, што пазнанне было нармальным на момант смерці, узровень амилоида быў анамальна высокі (сярэдняе CERAD, 2,8 ± 0,5) (табліца S1B).
TMT-MS аналіз гэтых 27 тканін мозгу прывёў да колькаснага вызначэння 11 244 пратэёмаў. Гэты канчатковы падлік уключае толькі тыя вавёркі, якія колькасна вызначаны як мінімум у 50% узораў. Гэты паўторны набор даных утрымлівае 8638 (98,0%) з 8817 бялкоў, выяўленых падчас аналізу галаўнога мозгу нашага адкрыцця, і змяшчае амаль 3000 значна змененых бялкоў паміж кантрольнай групай і кагортамі AD (P <0,05, пасля парнага t-крытэра Т'юкі для дысперсійнага аналізу) ( Табліца S2F). Сярод гэтых бялкоў з дыферэнцыяльнай экспрэсіяй 910 таксама паказаў значныя змены ўзроўню паміж AD і кантрольнымі выпадкамі пратэома мозгу (P <0,05, пасля парнага t-тэсту ANOVA Tukey). Варта адзначыць, што гэтыя 910 маркераў вельмі ўзгадняюцца ў напрамку змены паміж пратэёмамі (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (малюнак S3A). Сярод павялічаных бялкоў вавёркі з найбольш паслядоўнымі зменамі паміж наборамі даных у асноўным з'яўляюцца членамі багатых гліяй модуляў M5 і M18 (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 і GFAP). Сярод паменшаных бялкоў тыя з найбольш паслядоўнымі зменамі былі амаль выключна членамі модуля M1 (NPTX2, VGF і RPH3A), звязанага з сінапсам. Далей мы праверылі звязаныя з AD змены midkine (MDK), CD44, сакрэтаванага frizzled-звязанага бялку 1 (SFRP1) і VGF з дапамогай Вестэрн-блот (малюнак S3B). Аналіз захаванасці модуля паказаў, што каля 80% бялковых модуляў (34/44) у пратэоме галаўнога мозгу былі значна захаваны ў наборы даных рэплікацыі (z-паказчык> 1,96, скарэкціраваны FDR P <0,05) (малюнак S3C). Чатырнаццаць з гэтых модуляў былі спецыяльна зарэзерваваны паміж двума пратэёмамі (z-бал> 10, FDR скарэкціраваны P <1,0 × 10-23). У цэлым, адкрыццё і рэплікацыя высокай ступені ўзгодненасці ў дыферэнцыяльнай экспрэсіі і модульнай кампазіцыі паміж пратэомамі мозгу падкрэслівае ўзнаўляльнасць змяненняў у вавёрках лобнай кары AD. Акрамя таго, гэта таксама пацвердзіла, што AsymAD і больш запушчаныя захворванні маюць вельмі падобную структуру сеткі мозгу.
Больш падрабязны аналіз дыферэнцыяльнай экспрэсіі ў наборы дадзеных рэплікацыі галаўнога мозгу падкрэслівае значную ступень змяненняў бялку AsymAD, уключаючы ў агульнай складанасці 151 значна зменены бялок паміж AsymAD і кантролем (P <0,05) (малюнак S3D). У адпаведнасці з амілаіднай нагрузкай, АРР у мозгу AsymAD і AD значна павялічыўся. MAPT істотна змяняецца толькі пры AD, што адпавядае павышэнню ўзроўню клубкоў і яго вядомай карэляцыі са зніжэннем кагнітыўных здольнасцей (5, 7). Модулі, багатыя гліяй (M5 і M18), моцна адлюстроўваюцца на павелічэнні колькасці бялкоў у AsymAD, у той час як звязаны з нейронамі модуль M1 з'яўляецца найбольш рэпрэзентатыўным сярод паніжаных бялкоў у AsymAD. Многія з гэтых маркераў AsymAD паказваюць большыя змены ў сімптаматычных захворваннях. Сярод гэтых маркераў - SMOC1, глиальный бялок, які належыць да M18, які звязаны з пухлінамі мозгу і развіццём вачэй і канечнасцяў (32). MDK - гэта фактар росту, які звязвае гепарын, звязаны з ростам клетак і ангіягенезам (33), яшчэ адным членам M18. У параўнанні з кантрольнай групай, AsymAD значна павялічыўся, а затым большае павышэнне AD. Наадварот, сінаптычны бялок нейропентраксин 2 (NPTX2) быў значна зніжаны ў мозгу AsymAD. NPTX2 раней быў звязаны з нейродегенерацией і мае прызнаную ролю ў апасродкаванні ўзбуджальных сінапсаў (34). У цэлым, гэтыя вынікі выяўляюць розныя даклінічныя змены бялку пры AD, якія, здаецца, прагрэсуюць з цяжарам захворвання.
Улічваючы, што мы дасягнулі значнай глыбіні ахопу бялком у адкрыцці пратэома мозгу, мы спрабуем больш поўна зразумець яго супадзенне з транскрыптомам AD сеткавага ўзроўню. Такім чынам, мы параўналі пратэём мозгу, які мы выявілі, з модулем, які мы раней згенеравалі з вымярэння мікрачыпаў 18204 генаў AD (n = 308) і кантрольных (n = 157) DLPFC тканін (13). перакрыцце. У агульнай складанасці мы вызначылі 20 розных модуляў РНК, многія з якіх дэманстравалі ўзбагачэнне пэўных тыпаў клетак, уключаючы нейроны, алігадэндрацыты, астрацыты і мікраглію (малюнак 3A). Множныя змены гэтых модуляў у AD паказаны на малюнку 3B. У адпаведнасці з нашым папярэднім аналізам перакрыцця бялку і РНК з выкарыстаннем больш глыбокага немеченого пратэома MS (каля 3000 бялкоў) (13), большасць з 44 модуляў у сетцы пратэомаў галаўнога мозгу, якія мы знайшлі, знаходзяцца ў сетцы транскрыптомаў. Значнага перакрыцця няма. Нават у наша адкрыццё і рэплікацыя 34 бялковых модуляў, якія моцна захоўваюцца ў пратэёме галаўнога мозгу, толькі 14 (~40%) прайшлі дакладны тэст Фішэра (FET), даказалі, што яны маюць статыстычна значнае перакрыцце з транскрыптомам (малюнак 3A). Сумяшчальны з аднаўленнем пашкоджанняў ДНК (P-M25 і P-M19), трансляцыяй бялкоў (P-M7 і P-M20), звязваннем/сплайсінгам РНК (P-M16 і P-M21) і нацэльваннем бялку (P-M13 і P- M23) не перакрываецца з модулямі ў транскрыптоме. Такім чынам, хоць у бягучым аналізе перакрыццяў выкарыстоўваецца больш глыбокі набор дадзеных пратэёмаў (13), большая частка протеома сеткі AD не адлюстроўваецца на сетцы транскрыпта.
(A) Гіпергеаметрычны FET дэманструе ўзбагачэнне спецыфічных маркераў клетачнага тыпу ў РНК-модулі транскрыптому AD (уверсе) і ступень перакрыцця паміж РНК (вось х) і бялковымі (вось y) модулямі мозгу AD (унізе) . Інтэнсіўнасць чырвонага зацянення паказвае ступень ўзбагачэння тыпаў клетак на верхняй панэлі і інтэнсіўнасць перакрыцця модуляў на ніжняй панэлі. Зорачкі паказваюць на статыстычную значнасць (P <0,05). (B) Ступень карэляцыі паміж характэрнымі генамі кожнага транскриптомного модуля і статусам AD. Модулі злева найбольш адмоўна карэлююць з AD (сіні), а модулі справа найбольш станоўча карэлююць з AD (чырвоны). Лагартрансфармаванае значэнне P з карэкцыяй BH паказвае ступень статыстычнай значнасці кожнай карэляцыі. (C) Значныя перакрываюцца модулі з агульным узбагачэннем тыпу клетак. (D) Карэляцыйныя аналіз log2 кратнага змены пазначанага бялку (вось X) і РНК (вось Y) у модулі перакрыцця. Адлюстроўваецца каэфіцыент карэляцыі Пірсана з адпаведным значэннем P. Мікра, мікраглія; нябесных цел, астр. ЦТ, кантроль.
Большасць бялковых і РНК-модуляў, якія перакрываюцца, маюць падобныя профілі ўзбагачэння клеткавага тыпу і паслядоўныя напрамкі змены AD (малюнак 3, B і C). Іншымі словамі, звязаны з сінапсам модуль M1 пратэома мозгу (PM1) адлюстроўваецца на трох багатых нейронамі гамалагічных РНК-модулях (R-M1, R-M9 і R-M16), якія знаходзяцца ў AD. Абодва паказалі паніжаны ўзровень. Аналагічным чынам багатыя гліяй бялковыя модулі M5 і M18 перакрываюцца з модулямі РНК, багатымі астрацытамі і мікрагліяльнымі маркерамі (R-M3, R-M7 і R-M10), і яны моцна ўдзельнічаюць у павелічэнні захворванняў. Гэтыя агульныя модульныя функцыі паміж двума наборамі даных дадаткова падтрымліваюць узбагачэнне тыпу клетак і звязаныя з хваробай змены, якія мы назіралі ў пратэоме мозгу. Тым не менш, мы назіралі шмат істотных адрозненняў паміж узроўнямі РНК і бялку асобных маркераў у гэтых агульных модулях. Карэляцыйны аналіз дыферэнцыяльнай экспрэсіі пратэёмікі і транскрыптамікі малекул у гэтых перакрываючыхся модулях (малюнак 3D) падкрэслівае гэтую неадпаведнасць. Напрыклад, APP і некалькі іншых бялкоў глиального модуля (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 і SFRP1) паказалі значнае павелічэнне пратэома AD, але амаль не было змен у транскрыптоме AD. Гэтыя бялковыя спецыфічныя змены могуць быць цесна звязаны з амілаіднымі бляшкамі (23, 35), вылучаючы пратэём як крыніцу паталагічных змен, і гэтыя змены могуць не адлюстроўвацца ў транскрыптоме.
Пасля незалежнага аналізу пратэёмаў галаўнога мозгу і ліквора, якія мы выявілі, мы правялі ўсебаковы аналіз двух набораў даных, каб вызначыць біямаркеры AD CSF, звязаныя з патафізіялогіяй мазгавой сеткі. Спачатку мы павінны вызначыць перакрыцце двух пратэёмаў. Хаця шырока прызнана, што СМЖ адлюстроўвае нейрахімічныя змены ў галаўным мозгу БА (4), дакладная ступень супадзення паміж мозгам БА і протеомом СМЖ незразумелая. Параўноўваючы колькасць агульных генных прадуктаў, выяўленых у нашых двух пратэёмах, мы выявілі, што амаль 70% (n = 1936) бялкоў, ідэнтыфікаваных у спіннамазгавой вадкасці, былі таксама колькасна вызначаны ў галаўным мозгу (малюнак 4A). Большасць з гэтых бялкоў, якія перакрываюцца (n = 1721), супастаўляюцца з адным з 44 модуляў сумеснай экспрэсіі з набору даных мозгу адкрыцця (малюнак 4B). Як і чакалася, шэсць найбуйнейшых модуляў мозгу (M1 да M6) прадэманстравалі найбольшую колькасць перакрыцця СМЖ. Аднак ёсць меншыя мазгавыя модулі (напрыклад, M15 і M29), якія дасягаюць нечакана высокай ступені перакрыцця, большай, чым мазгавы модуль удвая большы. Гэта падахвочвае нас прыняць больш падрабязны, статыстычна абгрунтаваны метад разліку супадзення паміж мозгам і спіннамазгавой вадкасцю.
(A і B) Вавёркі, выяўленыя ў наборах даных мозгу адкрыцця і СМЖ, перакрываюцца. Большасць з гэтых бялкоў, якія перакрываюцца, звязаны з адным з 44 модуляў сумеснай экспрэсіі сеткі сумеснай экспрэсіі мозгу. (C) Адкрыйце для сябе перакрыцце паміж пратэёмам спіннамазгавой вадкасці і пратэёмам сеткі мозгу. Кожны радок цеплавой карты ўяўляе асобны аналіз перакрыцця гіпергеаметрычнага FET. Верхні радок адлюстроўвае перакрыцце (шэрае/чорнае зацяненне) паміж модулем мозгу і ўсім пратэёмам СМЖ. Другі радок паказвае, што перакрыцце паміж модулямі галаўнога мозгу і бялком СМЖ (заштрафаваны чырвоным колерам) значна павышаецца пры БА (Р <0,05). Трэці радок паказвае, што перакрыцце паміж модулямі галаўнога мозгу і бялком СМЖ (блакітнае зацяненне) значна зніжаецца пры AD (P <0,05). Выкарыстоўвайце метад BH, каб выправіць значэнне P, атрыманае з FET. (D) Складаная модульная панэль на аснове асацыяцыі тыпаў ячэек і адпаведных тэрмінаў GO. Гэтыя панэлі ўтрымліваюць у агульнай складанасці 271 звязаны з галаўным мозгам бялок, якія маюць значную дыферэнцыяльную экспрэсію ў протеоме СМЖ.
Выкарыстоўваючы аднабаковыя палявыя транзістары, мы ацанілі важнасць перакрыцця бялкоў паміж протеомом СМЖ і асобнымі модулямі мозгу. Аналіз паказаў, што ў агульнай складанасці 14 модуляў галаўнога мозгу ў наборы даных СМЖ маюць статыстычна значнае перакрыцце (скарэкціраваны FDR P <0,05) і дадатковы модуль (M18), перакрыцце якога блізкае да значнасці (скарэкціраваны FDR P = 0,06) (малюнак 4C , верхні радок). Мы таксама зацікаўлены ў модулях, якія моцна перакрываюцца з дыферэнцыяльна экспрессируемыми вавёркамі СМЖ. Такім чынам, мы ўжылі два дадатковых аналізу FET, каб вызначыць, які з (i) бялку СМЖ быў значна павышаны пры AD і (ii) бялок CSF быў значна зніжаны пры AD (P <0,05, парны t-тэст AD/control) Модулі мозгу са значным перакрыццем паміж імі. Як паказана ў сярэднім і ніжнім радках малюнка 4C, гэтыя дадатковыя аналізы паказваюць, што 8 з 44 модуляў мозгу значна перакрываюцца з бялком, дададзеным у СМЖ AD (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 і M38). . ), у той час як толькі два модулі (M6 і M15) паказалі значнае перакрыцце з паменшаным бялком у AD CSF. Як і чакалася, усе 10 модуляў знаходзяцца ў 15 модулях з найбольшым перакрыццем з пратэомам CSF. Такім чынам, мы мяркуем, што гэтыя 15 модуляў з'яўляюцца высокапрадукцыйнымі крыніцамі биомаркеров спіннамазгавой вадкасці мозгу AD.
Мы склалі гэтыя 15 модуляў, якія перакрываюцца, у пяць вялікіх бялковых панэляў на аснове іх блізкасці ў дрэвападобнай дыяграме WGCNA і іх сувязі з тыпамі клетак і анталогіяй генаў (малюнак 4D). Першая панэль утрымлівае модулі, багатыя маркерамі нейронаў і бялкамі, звязанымі з сінапсамі (M1 і M12). Сінаптычная панэль змяшчае ў агульнай складанасці 94 вавёркі, і ўзроўні ў пратэоме СМЖ значна змяніліся, што робіць яго найбуйнейшай крыніцай звязаных з мозгам маркераў СМЖ сярод пяці панэляў. Другая група (М6 і М15) прадэманстравала цесную сувязь з маркерамі эндотелиальных клетак і сасудзістым целам, такімі як «гаенне ран» (М6) і «рэгуляцыя гумаральнага імуннага адказу» (М15). M15 таксама моцна звязаны з метабалізмам ліпапратэінаў, які цесна звязаны з эндатэлем (36). Сасудзістая панэль змяшчае 34 маркера СМЖ, якія адносяцца да мозгу. Трэцяя група ўключае модулі (М2 і М4), якія істотна звязаны з маркерамі олигодендроцитов і праліферацыі клетак. Напрыклад, тэрміны анталогіі верхняга ўзроўню M2 ўключаюць «станоўчую рэгуляцыю рэплікацыі ДНК» і «працэс біясінтэзу пурынаў». Між тым, тыя з M4 ўключаюць «дыферэнцыяцыю глиальных клетак» і «сегрэгацыю храмасом». Панэль миелинизации змяшчае 49 маркераў СМЖ, звязаных з мозгам.
Чацвёртая група змяшчае большасць модуляў (M30, M29, M18, M24 і M5), і амаль усе модулі значна багатыя маркерамі мікрагліі і астрацытаў. Падобна панэлі миелинизации, чацвёртая панэль таксама змяшчае модулі (M30, M29 і M18), якія цесна звязаны з праліферацыяй клетак. Іншыя модулі гэтай групы цесна звязаны з імуналагічнымі тэрмінамі, такімі як «працэс імуннага эфекту» (M5) і «рэгуляцыя імуннага адказу» (M24). Глиальная імунная група змяшчае 42 маркера СМЖ, звязаныя з мозгам. Нарэшце, апошняя панэль уключае 52 звязаныя з мозгам маркеры на чатырох модулях (M44, M3, M33 і M38), усе з якіх знаходзяцца на целе, звязаныя з назапашваннем энергіі і абменам рэчываў. Самы вялікі з гэтых модуляў (M3) цесна звязаны з мітахондрыямі і багаты нейронаспецыфічнымі маркерамі. M38 з'яўляецца адным з меншых членаў модуля ў гэтым метаболоме, а таксама дэманструе ўмераную нейронавую спецыфічнасць.
У цэлым гэтыя пяць панэляў адлюстроўваюць шырокі спектр тыпаў клетак і функцый у кары галаўнога мозгу AD і ў сукупнасці ўтрымліваюць 271 маркер СМЖ, звязаны з мозгам (табліца S2G). Для таго, каб ацаніць абгрунтаванасць гэтых вынікаў MS, мы выкарысталі аналіз пашырэння блізкасці (PEA), тэхналогію на аснове артаганальных антыцелаў з магчымасцямі мультыплексавання, высокай адчувальнасцю і спецыфічнасцю, і паўторна прааналізавалі ўзоры спіннамазгавой вадкасці, якія мы выявілі. Падгрупа гэтых 271 біямаркераў (n = 36). Гэтыя 36 мішэняў дэманструюць змяненне кратнага AD для PEA, што цесна звязана з нашымі вынікамі MS (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), якія дакладна пацвердзілі вынікі нашага комплекснага аналізу MS (малюнак S4). ).
Біялагічныя тэмы, якія падкрэсліваюць нашы пяць груп, ад сінаптычнай сігналізацыі да энергетычнага абмену, усе звязаны з патагенезам AD (1-3). Такім чынам, усе 15 модуляў, якія змяшчаюць гэтыя панэлі, звязаны з паталогіяй AD у пратэёме мозгу, якую мы выявілі (малюнак 2B). Найбольш прыкметным з'яўляецца высокая станоўчая паталагічная карэляцыя паміж нашымі глиальными модулямі і моцная адмоўная паталагічная карэляцыя паміж нашымі найбуйнейшымі нейрональнымі модулямі (M1 і M3). Дыферэнцыяльны аналіз экспрэсіі нашага рэплікаванага пратэома мозгу (малюнак S3D) таксама вылучае глиальные вавёркі M5 і M18. Пры AsymAD і сімптаматычнай БА найбольш павялічваецца колькасць гліальных бялкоў і звязаных з M1 сінапсаў. Бялок зніжаецца найбольш. Гэтыя назіранні паказваюць, што 271 маркер спіннамазгавой вадкасці, які мы вызначылі ў пяці групах, звязаны з працэсамі захворвання ў кары AD, у тым ліку з тымі, якія адбываюцца на ранніх бессімптомных стадыях.
Каб лепш прааналізаваць кірунак змяненняў панэлі бялкоў у галаўным мозгу і спіннамазгавой вадкасці, мы намалявалі наступнае для кожнага з 15 перакрываючыхся модуляў: (i) знайшлі ўзровень дастатку модуля ў наборы дадзеных мозгу і (ii) модуль бялок Розніца выяўляецца ў спіннамазгавой вадкасці (малюнак S5). Як згадвалася раней, WGCNA выкарыстоўваецца для вызначэння колькасці модуля або характэрнага значэння бялку ў галаўным мозгу (13). Карта вулкана выкарыстоўваецца для апісання дыферэнцыяльнай экспрэсіі модульных бялкоў у спіннамазгавой вадкасці (AD/кантроль). Гэтыя лічбы паказваюць, што тры з пяці панэляў паказваюць розныя тэндэнцыі экспрэсіі ў мозгу і спіннамазгавой вадкасці. Два модулі панэлі сінапсаў (M1 і M12) дэманструюць зніжэнне ўзроўню колькасці ў галаўным мозгу AD, але значна супадаюць з павелічэннем колькасці бялку ў CSF AD (малюнак S5A). Модулі, звязаныя з нейронамі, якія змяшчаюць метабалом (M3 і M38), паказалі падобныя неадпаведныя схемы экспрэсіі ў галаўным мозгу і спіннамазгавой вадкасці (малюнак S5E). Судзінкавая панэль таксама паказала розныя тэндэнцыі экспрэсіі, хоць яе модулі (M6 і M15) былі ўмерана павялічаны ў галаўным мозгу AD і паменшаны ў хворай СМЖ (малюнак S5B). Астатнія дзве панэлі ўтрымліваюць вялікія гліяльныя сеткі, вавёркі якіх паслядоўна павышаюцца ў абодвух аддзяленнях (малюнак S5, C і D).
Звярніце ўвагу, што гэтыя тэндэнцыі не з'яўляюцца агульнымі для ўсіх маркераў на гэтых панэлях. Напрыклад, сінаптычная панэль уключае некалькі бялкоў, колькасць якіх у галаўным мозгу і СМЖ значна зніжана (малюнак S5A). Сярод гэтых маркераў спіннамазгавой вадкасці са зніжанай рэгуляцыяй - NPTX2 і VGF M1, а таксама храмагранін B M12. Аднак, нягледзячы на гэтыя выключэнні, большасць нашых сінаптычных маркераў павышаны ў спіннамазгавой вадкасці AD. У цэлым гэтыя аналізы змаглі адрозніць статыстычна значныя тэндэнцыі ва ўзроўні мозгу і спіннамазгавой вадкасці ў кожнай з нашых пяці панэляў. Гэтыя тэндэнцыі падкрэсліваюць складаную і часта розную сувязь паміж экспрэсіяй бялку ў галаўным мозгу і СМЖ пры БА.
Затым мы выкарысталі высокапрадукцыйны аналіз рэплікацыі MS (рэплікацыя CSF 1), каб звузіць наш набор з 271 біямаркераў да найбольш перспектыўных і ўзнаўляемых мішэняў (малюнак 5A). Копія CSF 1 змяшчае ў агульнай складанасці 96 узораў з Emory Goizueta ADRC, уключаючы кантроль, AsymAD і кагорту AD (табліца S1A). Гэтыя выпадкі AD характарызуюцца лёгкім зніжэннем кагнітыўных функцый (сярэдняе MoCA, 20,0 ± 3,8) і зменамі біямаркераў AD, пацверджанымі ў спіннамазгавой вадкасці (табліца S1A). У адрозненне ад аналізу ліквора, які мы выявілі, гэтая рэплікацыя выконваецца з выкарыстаннем больш эфектыўнага і высокапрадукцыйнага «аднаразовага» метаду МС (без аўтаномнага фракцыянавання), уключаючы спрошчаны пратакол падрыхтоўкі ўзораў, які пазбаўляе ад неабходнасці імунадэфіцыту асобных узораў. . Замест гэтага для ўзмацнення сігналу менш багатых бялкоў выкарыстоўваецца адзіны «канал павышэння імунітэту» (37). Нягледзячы на тое, што ён памяншае агульны ахоп протеома, гэты аднаразовы метад значна скарачае машынны час і павялічвае колькасць TMT-пазначаных узораў, якія могуць быць прааналізаваны жыццяздольнымі (17, 38). У агульнай складанасці аналіз выявіў 6487 пептыдаў, якія адлюстраваны ў 1183 пратэёмаў у 96 выпадках. Як і ў выпадку з аналізам СМЖ, які мы выявілі, у наступныя разлікі былі ўключаны толькі тыя вавёркі, якія колькасна вызначаліся як мінімум у 50% узораў, і дадзеныя былі рэгрэсіраваны з улікам узросту і полу. Гэта прывяло да канчатковай колькаснай ацэнкі 792 пратэёмаў, 95% з якіх таксама былі ідэнтыфікаваныя ў знойдзеным наборы дадзеных CSF.
(А) Звязаныя з галаўным мозгам бялковыя мішэні СМЖ, правераныя ў першай рэплікаванай кагорце СМЖ і ўключаныя ў канчатковую панэль (n = 60). (B - E) Узроўні біямаркераў панэлі (зводныя z-балы), вымераныя ў чатырох кагортах рэплікацыі СМЖ. Парныя t-крытэрыі або ANOVA з пост-карэкцыяй па Т'юкі выкарыстоўваліся для ацэнкі статыстычнай значнасці змяненняў у багацці ў кожным паўторным аналізе. ЦТ, кантроль.
Паколькі мы асабліва зацікаўлены ў праверцы нашай 271 мішэні ЦСЖ, звязанай з галаўным мозгам, з дапамогай комплекснага аналізу, мы абмяжуем далейшае даследаванне гэтага рэплікаванага пратэёма гэтымі маркерамі. Сярод гэтых 271 бялкоў 100 былі выяўлены ў рэплікацыі СМЖ 1. На малюнку S6A паказана дыферэнцыяльная экспрэсія гэтых 100 перакрываючыхся маркераў паміж кантрольнымі ўзорамі і ўзорамі рэплікацыі AD. Сінаптычныя і метабалітныя гистоны найбольш павялічваюцца пры AD, у той час як сасудзістыя вавёркі найбольш памяншаюцца пры захворванні. Большасць з 100 перакрываючыхся маркераў (n = 70) падтрымлівалі аднолькавы кірунак змены ў двух наборах дадзеных (малюнак S6B). Гэтыя 70 пацверджаных маркераў СМЖ, звязаных з галаўным мозгам (табліца S2H), у значнай ступені адлюстроўваюць раней назіраныя тэндэнцыі экспрэсіі панэлі, гэта значыць паніжальную рэгуляцыю сасудзістых бялкоў і павышаючую рэгуляцыю ўсіх астатніх панэляў. Толькі 10 з гэтых 70 пацверджаных бялкоў паказалі змены ў колькасці AD, якія супярэчылі гэтым тэндэнцыям панэлі. Для таго, каб стварыць панэль, якая найлепшым чынам адлюстроўвае агульную тэндэнцыю мозгу і спіннамазгавой вадкасці, мы выключылі гэтыя 10 бялкоў з цікавай панэлі, якую мы нарэшце праверылі (малюнак 5A). Такім чынам, наша панэль у канчатковым выніку ўключае ў сябе ў агульнай складанасці 60 бялкоў, правераных у дзвюх незалежных кагортах СМЖ AD з выкарыстаннем розных узораў падрыхтоўкі і аналізу платформы MS. Графікі экспрэсіі z-балаў гэтых канчатковых панэляў у кантрольнай копіі 1 ліквора і выпадках AD пацвердзілі панэльную тэндэнцыю, якую мы выявілі ў кагорце ліквора (малюнак 5B).
Сярод гэтых 60 бялкоў ёсць малекулы, якія, як вядома, звязаны з AD, такія як остеопонтин (SPP1), які з'яўляецца провоспалительным цітокінам, які ў многіх даследаваннях быў звязаны з AD (39-41), і GAP43, сінаптычны бялок што відавочна звязана з нейрадэгенерацыяй (42). Найбольш поўна правераныя вавёркі з'яўляюцца маркерамі, звязанымі з іншымі нейрадэгенератыўнымі захворваннямі, такімі як супероксиддисмутаза 1 (SOD1), звязаная з бакавым аміятрафічным склерозам (БАС), і дэсахараза, звязаная з хваробай Паркінсана (PARK7). Мы таксама пацвердзілі, што многія іншыя маркеры, такія як SMOC1 і сігнальны бялок 1 прымацавання да мембраны мозгу (BASP1), маюць абмежаваныя папярэднія сувязі з нейрадэгенерацыяй. Варта адзначыць, што з-за іх нізкай агульнай колькасці ў пратэоме СМЖ нам цяжка выкарыстоўваць гэты высокапрадукцыйны аднаразовы метад выяўлення для надзейнага выяўлення MAPT і некаторых іншых бялкоў, звязаных з AD (напрыклад, NEFL і NRGN ) (43, 44).
Затым мы праверылі гэтыя 60 маркераў прыярытэтных панэляў у трох дадатковых паўторных аналізах. У CSF Copy 2 мы выкарыстоўвалі адзін TMT-MS для аналізу незалежнай кагорты з 297 кантрольных і AD узораў з Emory Goizueta ADRC (17). Рэплікацыя CSF 3 уключала паўторны аналіз даступных дадзеных TMT-MS ад 120 пацыентаў з кантрольнай групы і AD з Лазаны, Швейцарыя (45). Мы выявілі больш за дзве траціны з 60 маркераў прыярытэту ў кожным наборы даных. Нягледзячы на тое, што ў швейцарскім даследаванні выкарыстоўваліся розныя платформы MS і метады колькаснага вызначэння TMT (45, 46), мы дакладна прайгралі нашы тэндэнцыі панэлі ў двух паўторных аналізах (малюнак 5, C і D і табліцы S2, I і J). Каб ацаніць спецыфічнасць захворвання ў нашай групе, мы выкарыстоўвалі TMT-MS для аналізу чацвёртага набору дадзеных рэплікацыі (рэплікацыя СМЖ 4), які ўключаў не толькі кантроль (n = 18) і AD (n = 17) выпадкі, але і PD ( n = 14), узоры ALS (n = 18) і лобна-скроневая дэменцыя (FTD) (n = 11) (табліца S1A). Мы паспяхова вызначылі колькасна амаль дзве траціны панэлі бялкоў у гэтай кагорце (38 з 60). Гэтыя вынікі падкрэсліваюць спецыфічныя для AD змены ва ўсіх пяці панэлях біямаркераў (малюнак 5E і табліца S2K). Павелічэнне групы метабалітаў паказала самую моцную спецыфічнасць AD, за якой ідуць миелинизация і глиальная група. У меншай ступені FTD таксама паказвае павелічэнне паміж гэтымі панэлямі, што можа адлюстроўваць аналагічныя патэнцыйныя змены сеткі (17). Наадварот, ALS і PD паказалі амаль такія ж профілі миелинизации, глии і метаболома, што і кантрольная група. У цэлым, нягледзячы на адрозненні ў падрыхтоўцы проб, платформе MS і метадах колькаснага вызначэння TMT, гэтыя паўторныя аналізы паказваюць, што нашы маркеры прыярытэтнай панэлі маюць вельмі паслядоўныя змены, характэрныя для AD, у больш чым 500 унікальных узорах СМЖ.
Нейрадэгенерацыя AD была шырока прызнана за некалькі гадоў да з'яўлення кагнітыўных сімптомаў, таму існуе вострая патрэба ў біямаркерах AsymAD (5, 31). Тым не менш, усё больш і больш доказаў паказваюць, што біялогія AsymAD далёкая ад аднастайнай, і складанае ўзаемадзеянне рызыкі і ўстойлівасці прыводзіць да вялікіх індывідуальных адрозненняў у наступным прагрэсаванні захворвання (47). Нягледзячы на тое, што выкарыстоўваюцца для ідэнтыфікацыі выпадкаў AsymAD, узровень асноўных біямаркераў спіннамазгавой вадкасці (Aβ1-42, агульны тау і p-tau) не даказаў магчымасці надзейна прадказаць, хто будзе прагрэсаваць да дэменцыі (4, 7), што сведчыць аб больш неабходна ўключыць цэласныя інструменты біямаркераў, заснаваныя на шматлікіх аспектах фізіялогіі мозгу, каб дакладна стратыфікаваць рызыку гэтай групы насельніцтва. Такім чынам, пасля мы прааналізавалі нашу пацверджаную AD панэль біямаркераў у папуляцыі AsymAD CSF копіі 1. Гэтыя 31 выпадак AsymAD паказалі анамальныя ўзроўні асноўных біямаркераў (суадносіны Aβ1–42/агульны тау ELISA, <5,5) і поўную кагнітыўную здольнасць (сярэдняе MoCA, 27,1). ± 2,2) (табл. S1A). Акрамя таго, усе людзі з AsymAD маюць клінічны бал дэменцыі 0, што сведчыць аб адсутнасці доказаў зніжэння штодзённай кагнітыўнай або функцыянальнай дзейнасці.
Спачатку мы прааналізавалі ўзроўні пацверджаных панэляў ва ўсіх 96 копіях CSF 1, уключаючы кагорту AsymAD. Мы выявілі, што некалькі панэляў у групе AsymAD мелі значныя змены колькасці, падобныя на AD, сасудзістая панэль паказала тэндэнцыю да зніжэння ў AsymAD, у той час як усе іншыя панэлі паказалі тэндэнцыю да росту (малюнак 6A). Такім чынам, усе панэлі паказалі вельмі значную карэляцыю з ELISA Aβ1-42 і агульным узроўнем тау (малюнак 6B). Наадварот, карэляцыя паміж групай і балам MoCA адносна слабая. Адной з найбольш яркіх высноваў гэтых аналізаў з'яўляецца вялікі дыяпазон колькасці панэляў у кагорце AsymAD. Як паказана на малюнку 6A, узровень панэлі групы AsymAD звычайна перасякае ўзровень панэлі кантрольнай групы і групы AD, дэманструючы адносна высокую зменлівасць. Для далейшага вывучэння гэтай гетэрагеннасці AsymAD мы ўжылі аналіз шматмернага маштабавання (MDS) да 96 выпадкаў рэплікацыі СМЖ 1. Аналіз MDS дазваляе візуалізаваць падабенства паміж выпадкамі на аснове пэўных зменных у наборы даных. Для гэтага кластарнага аналізу мы выкарыстоўваем толькі тыя пацверджаныя панэльныя маркеры, якія маюць статыстычна значныя змены (P <0,05, AD/кантроль) ва ўзроўні адкрыцця і рэплікацыі CSF 1 пратэома (n = 29) (табліца S2L). Гэты аналіз стварыў выразную прасторавую кластэрызацыю паміж нашымі кантрольнымі і выпадкамі AD (малюнак 6C). Наадварот, некаторыя выпадкі AsymAD выразна згрупаваны ў кантрольнай групе, у той час як іншыя знаходзяцца ў выпадках AD. Для далейшага вывучэння гэтай гетэрагеннасці AsymAD мы выкарысталі нашу карту MDS, каб вызначыць дзве групы гэтых выпадкаў AsymAD. Першая група ўключала выпадкі AsymAD, згрупаваныя бліжэй да кантролю (n = 19), у той час як другая група характарызавалася выпадкамі AsymAD з маркерным профілем, блізкім да AD (n = 12).
(A) Узровень экспрэсіі (z-бал) групы биомаркеров CSF ва ўсіх 96 узорах у кагорце рэплікацыі CSF 1, уключаючы AsymAD. Аналіз дысперсіі з пост-карэкцыяй Т'юкі быў выкарыстаны для ацэнкі статыстычнай значнасці змяненняў колькасці панэлі. (B) Карэляцыйны аналіз узроўню ўтрымання панэлі бялку (z-паказчык) з паказчыкам MoCA і агульным узроўнем тау ў ELISA Aβ1-42 і ўзорах копіі 1 СМЖ. Адлюстроўваецца каэфіцыент карэляцыі Пірсана з адпаведным значэннем P. (C) MDS 96 копій CSF 1 выпадкаў быў заснаваны на ўзроўнях колькасці 29 правераных панэльных маркераў, якія былі значна зменены як у наборах дадзеных адкрыцця, так і ў CSF копіі 1 [P <0,05 AD/кантроль (CT)]. Гэты аналіз быў выкарыстаны для падзелу групы AsymAD на кантрольную (n = 19) і AD (n = 12) падгрупы. (D) Графік вулкана паказвае дыферэнцыяльную экспрэсію ўсіх бялкоў рэплікацыі CSF 1 са зменай кратнасці log2 (вось х) адносна -log10 статыстычнага значэння P паміж двума падгрупамі AsymAD. Панэлі биомаркеров каляровыя. (E) Узровень рэплікацыі CSF 1 биомаркеров селекцыйнай групы па-рознаму экспрессируется паміж падгрупамі AsymAD. Для ацэнкі статыстычнай значнасці быў выкарыстаны дысперсійны аналіз Тьюкі з папраўкай на долю.
Мы вывучылі дыферэнцыяльную экспрэсію бялку паміж гэтымі кантрольнымі і AD-падобнымі выпадкамі AsymAD (малюнак 6D і табліца S2L). Атрыманая карта вулкана паказвае, што 14 маркераў панэлі істотна змяніліся паміж дзвюма групамі. Большасць з гэтых маркераў з'яўляюцца членамі сінапса і метаболома. Тым не менш, SOD1 і мірыстыляваны багаты аланін субстрат протеинкиназы С (MARCKS), якія з'яўляюцца членамі миелиновой і глиальной імунных груп адпаведна, таксама належаць да гэтай групы (малюнак 6, D і E). Сасудзістая панэль таксама ўнесла два маркеры, якія былі значна зніжаны ў групе AsymAD, падобнай на AD, у тым ліку AE, які звязвае бялок 1 (AEBP1) і член сямейства камлементу C9. Не было істотнай розніцы паміж кантрольнай і AD-падобнымі падгрупамі AsymAD у ELISA AB1-42 (P = 0,38) і p-tau (P = 0,28), але сапраўды была значная розніца ў агульным узроўні tau (P = 0,0031). ) (мал. S7). Ёсць некалькі панэльных маркераў, якія паказваюць, што змены паміж дзвюма падгрупамі AsymAD больш значныя, чым агульныя ўзроўні тау (напрыклад, YWHAZ, SOD1 і MDH1) (малюнак 6E). У цэлым, гэтыя вынікі паказваюць, што наша правераная панэль можа ўтрымліваць біямаркеры, якія могуць падтыпаваць і стратыфікаваць патэнцыйную рызыку пацыентаў з бессімптомнай хваробай.
Існуе вострая патрэба ў сістэмных інструментах біямаркераў для лепшага вымярэння і нацэльвання розных патафізіялогій, якія стаяць за AD. Чакаецца, што гэтыя інструменты не толькі зменяць нашу сістэму дыягностыкі AD, але і паспрыяюць прыняццю эфектыўных стратэгій лячэння, арыентаваных на канкрэтнага пацыента (1, 2). З гэтай мэтай мы ўжылі аб'ектыўны ўсёабдымны пратэёмічны падыход да AD галаўнога мозгу і СМЖ, каб вызначыць вэб-біямаркеры СМЖ, якія адлюстроўваюць шырокі спектр патафізіялогіі мозгу. Наш аналіз вырабіў пяць біямаркерных панэляў СМЖ, якія (я) адлюстроўваюць сінапсы, крывяносныя пасудзіны, міэлін, імунную і метабалічную дысфункцыю; (II) дэманстраваць моцную ўзнаўляльнасць на розных платформах MS; (iii) Паказаць прагрэсавальныя змены, характэрныя для захворвання, на ранніх і позніх стадыях AD. У цэлым, гэтыя высновы ўяўляюць сабой перспектыўны крок да распрацоўкі разнастайных, надзейных, вэб-арыентаваных інструментаў біямаркераў для даследаванняў AD і клінічнага прымянення.
Нашы вынікі дэманструюць высокую кансерватыўнасць арганізацыі пратэома сеткі мозгу AD і падтрымліваюць яго выкарыстанне ў якасці якара для сістэмнага развіцця біямаркераў. Наш аналіз паказвае, што два незалежныя наборы даных TMT-MS, якія змяшчаюць мозг AD і AsymAD, маюць моцную модульнасць. Гэтыя вынікі пашыраюць нашу папярэднюю працу, дэманструючы захаванне магутных модуляў больш чым 2000 тканін мозгу з некалькіх незалежных кагорт у лобнай, цемянной і скроневай кары (17). Гэтая кансенсусная сетка адлюстроўвае розныя змены, звязаныя з хваробай, якія назіраюцца ў бягучым даследаванні, у тым ліку павелічэнне багатых гліяй запаленчых модуляў і памяншэнне багатых нейронамі модуляў. Як і сучасныя даследаванні, гэтая буйнамаштабная сетка таксама мае значныя модульныя змены ў AsymAD, паказваючы мноства розных даклінічных патафізіялогіі (17).
Аднак у рамках гэтай вельмі кансерватыўнай сістэмнай структуры назіраецца больш дэталёвая біялагічная гетэрагеннасць, асабліва сярод людзей на ранніх стадыях AD. Наша панэль біямаркераў здольная адлюстраваць дзве падгрупы ў AsymAD, якія дэманструюць значную дыферэнцыяльную экспрэсію некалькіх маркераў СМЖ. Наша група змагла вылучыць біялагічныя адрозненні паміж гэтымі двума падгрупамі, якія не былі відавочныя на ўзроўні асноўных биомаркеров AD. У параўнанні з кантрольнай групай суадносіны Aβ1-42/агульны тау у гэтых людзей з AsymAD былі анамальна нізкімі. Аднак толькі агульныя ўзроўні тау істотна адрозніваліся паміж дзвюма падгрупамі AsymAD, у той час як ўзроўні Aβ1-42 і р-таў заставаліся адносна супастаўнымі. Паколькі высокі ліквор тау, здаецца, з'яўляецца лепшым прадказальнікам кагнітыўных сімптомаў, чым узровень Aβ1-42 (7), мы падазраем, што дзве кагорты AsymAD могуць мець розныя рызыкі прагрэсавання захворвання. Улічваючы абмежаваны памер выбаркі нашага AsymAD і адсутнасць падоўжных дадзеных, неабходныя далейшыя даследаванні, каб упэўнена зрабіць гэтыя высновы. Аднак гэтыя вынікі паказваюць, што сістэмная панэль СМЖ можа палепшыць нашу здольнасць эфектыўна стратыфікаваць людзей падчас бессімптомнай стадыі захворвання.
У цэлым нашы вынікі пацвярджаюць ролю некалькіх біялагічных функцый у патагенезе AD. Тым не менш, парушаны энергетычны абмен стаў галоўнай тэмай усіх нашых пяці правераных панэляў маркіроўкі. Метабалічныя вавёркі, такія як гіпаксанцін-гуанін-фосфарыбазілтрансфераза 1 (HPRT1) і лактатдэгідрагеназа A (LDHA), з'яўляюцца найбольш надзейна пацверджанымі сінаптычнымі біямаркерамі, якія паказваюць на тое, што павышэнне AD CSF з'яўляецца высокай узнаўляльнасцю полу. Нашы крывяносныя пасудзіны і глиальные панэлі таксама ўтрымліваюць некалькі маркераў, якія ўдзельнічаюць у метабалізме акісляльных рэчываў. Гэтыя высновы адпавядаюць ключавой ролі, якую метабалічныя працэсы гуляюць ва ўсім мозгу не толькі для задавальнення высокіх энергетычных патрэбаў нейронаў, але і для задавальнення высокіх энергетычных патрэбаў астрацытаў і іншых глиальных клетак (17, 48). Нашы вынікі пацвярджаюць усё больш доказаў таго, што змены акісляльна-аднаўленчага патэнцыялу і перапыненне энергетычных шляхоў могуць быць асноўнай сувяззю паміж некалькімі ключавымі працэсамі, якія ўдзельнічаюць у патагенезе AD, уключаючы мітахандрыяльныя засмучэнні, апасродкаванае гліяй запаленне і пашкоджанне сасудаў (49). Акрамя таго, метабалічныя біямаркеры спіннамазгавой вадкасці ўтрымліваюць вялікую колькасць рознабагатых бялкоў паміж нашай кантрольнай і AD-падобнымі падгрупамі AsymAD, што сведчыць аб тым, што парушэнне гэтых энергетычных і акісляльна-аднаўленчых шляхоў можа мець вырашальнае значэнне на даклінічнай стадыі захворвання.
Розныя тэндэнцыі панэлі мозгу і спіннамазгавой вадкасці, якія мы назіралі, таксама маюць цікавыя біялагічныя наступствы. Сінапсы і метаболомы, багатыя нейронамі, паказваюць зніжэнне ўзроўню ў галаўным мозгу AD і павелічэнне колькасці ў спіннамазгавой вадкасці. Улічваючы, што нейроны багатыя выпрацоўваючымі энергію мітахондрыямі ў сінапсах, якія забяспечваюць энергію для сваіх шматлікіх спецыялізаваных сігналаў (50), чакаецца падабенства профіляў экспрэсіі гэтых дзвюх груп нейронаў. Страта нейронаў і экструзія пашкоджаных клетак можа растлумачыць гэтыя тэндэнцыі панэлі галаўнога мозгу і ліквора ў далейшым захворванні, але яны не могуць растлумачыць раннія змены панэлі, якія мы назіраем (13). Адным з магчымых тлумачэнняў гэтых знаходак на ранніх стадыях бессімптомнай хваробы з'яўляецца анамальная сінаптычная абрэзка. Новыя дадзеныя на мышыных мадэлях сведчаць аб тым, што апасродкаваны мікрагліяй сінаптычны фагацытоз можа быць ненармальна актываваны пры БА і прывесці да ранняй страты сінапсаў у галаўным мозгу (51). Гэты выкінуты сінаптычны матэрыял можа назапашвацца ў СМЖ, таму мы назіраем павелічэнне СМЖ у панэлі нейронаў. Імунаапасродкаванае сінаптычнае абразанне таксама можа часткова растлумачыць павелічэнне глиальных бялкоў, якія мы назіраем у галаўным мозгу і спіннамазгавой вадкасці на працягу ўсяго працэсу захворвання. У дадатак да сінаптычнай абрэзкі, агульныя анамаліі ў шляху экзацытаў таксама могуць прывесці да рознай экспрэсіі нейрональных маркераў у мозгу і СМЖ. Шэраг даследаванняў паказаў, што змянілася ўтрыманне экзасом у патагенезе AD галаўнога мозгу (52). Пазаклеткавай шлях таксама ўдзельнічае ў праліферацыі Aβ (53, 54). Варта адзначыць, што падаўленне экзасомальнай сакрэцыі можа паменшыць AD-падобную паталогію ў мадэлях AD трансгенных мышэй (55).
У той жа час, бялок у сасудзістай панэлі паказаў умеранае павелічэнне AD галаўнога мозгу, але значна знізіўся ў CSF. Дысфункцыя гематоэнцефаліческій бар'ера (ГЭБ) можа часткова растлумачыць гэтыя вынікі. Многія незалежныя пасмяротныя даследаванні на людзях прадэманстравалі распад ГЭБ пры БА (56, 57). Гэтыя даследаванні пацвердзілі розныя анамальныя дзеянні вакол гэтага шчыльна закрытага пласта эндотелиальных клетак, уключаючы ўцечку з капіляраў галаўнога мозгу і периваскулярное назапашванне бялкоў, якія перадаюцца крывёй (57). Гэта можа даць простае тлумачэнне павышэння сасудзістых бялкоў у галаўным мозгу, але яно не можа цалкам растлумачыць знясіленне гэтых жа бялкоў у спіннамазгавой вадкасці. Адна з магчымасцей заключаецца ў тым, што цэнтральная нервовая сістэма актыўна ізалюе гэтыя малекулы, каб вырашыць праблему ўзмацнення запалення і акісляльнага стрэсу. Зніжэнне некаторых з найбольш сур'ёзных бялкоў СМЖ у гэтай панэлі, асабліва тых, якія ўдзельнічаюць у рэгуляцыі ліпапратэінаў, звязана з інгібіраваннем шкодных узроўняў запалення і нейропротекторным працэсам актыўных формаў кіслароду. Гэта дакладна для параксоназы 1 (PON1), фермента, які звязвае ліпапратэіны, адказнага за зніжэнне ўзроўню акісляльнага стрэсу ў цыркуляцыі (58, 59). Папярэднік альфа-1-мікраглабуліну/бікуніну (AMBP) з'яўляецца яшчэ адным значна паніжаным маркерам сасудзістай групы. Гэта папярэднік транспарцёра ліпідаў бікуніна, які таксама ўдзельнічае ў падаўленні запалення і неўралагічнай абароне (60, 61).
Нягледзячы на розныя цікавыя гіпотэзы, немагчымасць непасрэдна выявіць біяхімічныя механізмы захворвання з'яўляецца добра вядомым абмежаваннем аналізу пратэёмікі, заснаванага на адкрыццях. Такім чынам, неабходныя далейшыя даследаванні, каб упэўнена вызначыць механізмы гэтых панэляў біямаркераў. Для таго, каб рухацца да развіцця клінічнага аналізу на аснове РС, будучы кірунак таксама патрабуе выкарыстання мэтавых колькасных метадаў для буйнамаштабнай праверкі біямаркераў, такіх як селектыўны або паралельны маніторынг рэакцыі (62). Нядаўна мы выкарыстоўвалі паралельны маніторынг рэакцыі (63) для пацверджання многіх апісаных тут змяненняў бялку СМЖ. Некалькі прыярытэтных мішэняў панэляў колькасна вызначаюцца са значнай дакладнасцю, у тым ліку YWHAZ, ALDOA і SMOC1, якія супастаўляюцца з нашымі панэлямі сінапсаў, метабалізму і запалення адпаведна (63). Незалежны збор даных (DIA) і іншыя стратэгіі на аснове MS таксама могуць быць карыснымі для мэтавай праверкі. Буд і інш. (64) Нядаўна было прадэманстравана, што існуе значнае перакрыцце паміж биомаркерами AD, выяўленымі ў нашым наборы дадзеных адкрыцця СМЖ і незалежным наборам дадзеных DIA-MS, які складаецца з амаль 200 узораў СМЖ з трох розных еўрапейскіх кагорт. Гэтыя нядаўнія даследаванні пацвярджаюць патэнцыял нашых панэляў для пераўтварэння ў надзейнае выяўленне на аснове РС. Традыцыйнае выяўленне антыцелаў і аптамераў таксама важна для далейшага развіцця ключавых біямаркераў AD. З-за нізкай колькасці СМЖ складаней выявіць гэтыя біямаркеры з дапамогай высокапрадукцыйных метадаў РС. NEFL і NRGN з'яўляюцца двума такімі прыкладамі біямаркераў CSF з нізкім утрыманнем, якія адлюстроўваюцца на панэлі ў нашым комплексным аналізе, але не могуць быць надзейна выяўлены з дапамогай нашай адзінай стратэгіі MS. Стратэгіі прыцэльвання на аснове некалькіх антыцелаў, такіх як PEA, могуць спрыяць клінічнай трансфармацыі гэтых маркераў.
У цэлым, гэта даследаванне забяспечвае унікальны пратэёмічны падыход для ідэнтыфікацыі і праверкі биомаркеров AD СМЖ на аснове розных сістэм. Аптымізацыя гэтых панэляў маркераў для дадатковых кагорт AD і платформаў MS можа апынуцца перспектыўнай для прасоўвання стратыфікацыі і лячэння рызыкі AD. Даследаванні, якія ацэньваюць падоўжны ўзровень гэтых панэляў з цягам часу, таксама маюць вырашальнае значэнне для вызначэння таго, якая камбінацыя маркераў найлепшым чынам стратыфікуе рызыку ранняга захворвання і змены цяжару захворвання.
За выключэннем 3 узораў, скапіяваных CSF, усе ўзоры CSF, выкарыстаныя ў гэтым даследаванні, былі сабраныя пад эгідай Emory ADRC або цесна звязаных даследчых устаноў. У агульнай складанасці ў гэтых пратэёмічных даследаваннях былі выкарыстаны чатыры наборы узораў СМЖ Эмары. Было выяўлена, што кагорта СМЖ змяшчае ўзоры 20 здаровых кантрольных асоб і 20 пацыентаў з AD. Копія 1 СМЖ уключае ўзоры 32 здаровых асобін кантролю, 31 асобы AsymAD і 33 асобін AD. Копія CSF 2 змяшчае 147 кантрольных і 150 узораў AD. Кагорта рэплікацыі CSF 4 пры некалькіх захворваннях уключала 18 кантрольных, 17 узораў AD, 19 ALS, 13 PD і 11 FTD. Згодна з пагадненнем, зацверджаным Інстытуцыйным аглядным саветам універсітэта Эмары, усе ўдзельнікі даследавання Эмары атрымалі інфармаваную згоду. У адпаведнасці з рэкамендацыямі па перадавой практыцы Нацыянальнага інстытута старэння для цэнтраў хваробы Альцгеймера 2014 г. (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), спіннамазгавая вадкасць збіралася і захоўвалася шляхам люмбальнай пункцыі. Пацыенты кантрольнай групы і AsymAD і AD атрымалі стандартызаваную кагнітыўную ацэнку ў клініцы кагнітыўнай неўралогіі Emory або Goizueta ADRC. Іх ўзоры спіннамазгавой вадкасці былі правераны INNO-BIA AlzBio3 Luminex на ELISA Aβ1-42, агульны тау і p-tau аналіз (65). Значэнні ELISA выкарыстоўваюцца для падтрымкі дыягнастычнай класіфікацыі суб'ектаў на аснове ўстаноўленых крытэрыяў адсячэння биомаркеров AD (66, 67). Асноўныя дэмаграфічныя і дыягнастычныя дадзеныя для іншых дыягназаў CSF (FTD, ALS і PD) таксама атрыманы ў Emory ADRC або афіляваных навукова-даследчых установах. Зводныя метаданыя выпадкаў для гэтых выпадкаў СМЖ Эмары можна знайсці ў табліцы S1A. Характарыстыкі швейцарскай кагорты рэплікацыі CSF 3 былі апублікаваныя раней (45).
СМЖ знайшоў узор. Для таго, каб павялічыць глыбіню нашага адкрыцця набору дадзеных СМЖ, перад трыпсінізацыяй было праведзена імуннае спажыванне бялкоў з высокім утрыманнем. Карацей кажучы, 130 мкл СМЖ з 40 індывідуальных узораў СМЖ і роўны аб'ём (130 мкл) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) былі змешчаны ў спінінг-калонку (Thermo Fisher Scientific, A89868) у пакоі. тэмпература Інкубаваць). Пасля адціску на працягу 15 хвілін адцэнтрыфугуйце ўзор пры 1000 г на працягу 2 хвілін. Ультрацэнтрыфужны фільтр 3K (Millipore, UFC500396) быў выкарыстаны для канцэнтрацыі ўзору сцёкаў шляхам цэнтрыфугавання пры 14000g на працягу 30 хвілін. Развядзіце ўсе аб'ёмы ўзораў да 75 мкл фізіялагічным растворам з фасфатным буферам. Канцэнтрацыю бялку ацэньвалі метадам бицинхониновой кіслаты (BCA) у адпаведнасці з пратаколам вытворцы (Thermo Fisher Scientific). ЦСЖ з знясіленнем імунітэту (60 мкл) з усіх 40 узораў расшчаплялі лизилэндопептидазой (LysC) і трыпсінаў. Карацей кажучы, узор аднаўлялі і алкілявалі 1,2 мкл 0,5 М трыс-2(-карбаксіэтыл)-фасфіну і 3 мкл 0,8 М хлорацетаміду пры 90°C на працягу 10 хвілін, а затым апрацоўвалі ультрагукам на вадзяной лазні на працягу 15 хвілін. Узор разбаўлялі 193 мкл 8 М мачавіны буфера [8 М мачавіны і 100 мм NaHPO4 (pH 8,5)] да канчатковай канцэнтрацыі 6 М мачавіны. LysC (4,5 мкг; Wako) выкарыстоўваецца для начнога стрававання пры пакаёвай тэмпературы. Затым пробу разводзяць да 1 М мачавіны 50 мМ бікарбанату амонія (ABC) (68). Дадайце роўную колькасць (4,5 мкг) трыпсінаў (Promega), а затым інкубуйце ўзор на працягу 12 гадзін. Падкісліце перавараны пептыдны раствор да канчатковай канцэнтрацыі 1% мурашынай кіслаты (FA) і 0,1% трыфторуксусной кіслаты (TFA) (66), а затым абяссольце калонкай Sep-Pak C18 50 мг (Вада), як апісана вышэй (25) . Пептыда затым элюировали ў 1 мл 50% ацэтанітрылу (ACN). Для стандартызацыі колькаснага вызначэння бялку ў партыях (25) аліквоты па 100 мкл з усіх 40 узораў СМЖ былі аб'яднаны для атрымання змешанага ўзору, які затым падзелены на пяць узораў глабальнага ўнутранага стандарту (GIS) (48). Усе асобныя ўзоры і камбінаваныя стандарты сушаць з дапамогай высакахуткаснага вакууму (Labconco).
CSF капіюе ўзор. Дэйон і яго калегі раней апісвалі знясіленне імунітэту і пераварванне ўзораў копіі 3 СМЖ (45, 46). Астатнія паўторныя ўзоры не былі індывідуальна знясіленыя. Пераварыце гэтыя нявыдаленыя ўзоры ў трыпсінаў, як апісана раней (17). Для кожнага паўторнага аналізу, 120 мкл аликвоты элюированного пептыда з кожнага ўзору былі аб'яднаны разам і падзелены на роўныя аликвоты аб'ёму, якія будуць выкарыстоўвацца ў якасці TMT-маркіраваных глабальнага ўнутранага стандарту (48). Усе асобныя ўзоры і камбінаваныя стандарты сушаць з дапамогай высакахуткаснага вакууму (Labconco). Каб узмацніць сігнал бялку СМЖ з нізкім утрыманнем, шляхам аб'яднання 125 мкл з кожнага ўзору для кожнага паўторнага аналізу рыхтавалі «палепшаны» ўзор [г.зн. біялагічны ўзор, які імітуе даследчы ўзор, але даступная колькасць роўная значна большы (37, 69)] аб'яднаны ў змешаны ўзор СМЖ (17). Затым змешаны ўзор быў імунна выдалены з выкарыстаннем 12 мл High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), перавараны, як апісана вышэй, і ўключаны ў наступную шматразовую маркіроўку TMT.
Час публікацыі: 27 жніўня 2021 г