Дзякуй за наведванне Nature.com. Версія браўзера, якую вы выкарыстоўваеце, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага вопыту мы рэкамендуем вам выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем візуалізаваць сайт без стыляў і JavaScript.
Цеплалюбівыя мікраарганізмы, якія развіваюцца пры высокіх тэмпературах. Іх вывучэнне можа даць каштоўную інфармацыю аб тым, як жыццё прыстасоўваецца да экстрэмальных умоў. Аднак з дапамогай звычайных аптычных мікраскопаў цяжка дасягнуць высокіх тэмпературных умоў. Было прапанавана некалькі самаробных рашэнняў на аснове лакальнага рэзістыўнага электрычнага нагрэву, але простага камерцыйнага рашэння няма. У гэтым артыкуле мы прадстаўляем канцэпцыю мікрамаштабнага лазернага нагрэву ў полі зроку мікраскопа, каб забяспечыць высокія тэмпературы для тэрмафільных даследаванняў, захоўваючы пры гэтым мяккае асяроддзе карыстальніка. Мікрамаштабны нагрэў пры ўмеранай інтэнсіўнасці лазера можа быць дасягнуты з дапамогай падкладкі, пакрытай наначасціцамі золата, у якасці біясумяшчальнага і эфектыўнага паглынальніка святла. Абмяркоўваюцца магчымыя эфекты мікрамаштабнай канвекцыі вадкасці, утрымання клетак і цэнтрабежнага термофоретического руху. Метад быў прадэманстраваны на двух відах: (i) Geobacillus stearothermophilus, актыўнай цеплалюбівай бактэрыі, якая размнажаецца пры тэмпературы каля 65°C, якая, як мы назіралі, прарастае, расце і плавае пры награванні ў мікрамаштабе; (ii) Thiobacillus sp., аптымальна гіпертэрмафільная архея. пры 80°C. Гэтая праца адкрывае шлях для простага і бяспечнага назірання за цеплалюбівымі мікраарганізмамі з выкарыстаннем сучасных і даступных інструментаў мікраскапіі.
На працягу мільярдаў гадоў жыццё на Зямлі развівалася, каб адаптавацца да шырокага дыяпазону ўмоў навакольнага асяроддзя, якія часам лічацца экстрэмальнымі з пункту гледжання нашага чалавека. У прыватнасці, некаторыя цеплалюбівыя мікраарганізмы (бактэрыі, археі, грыбы), званыя тэрмафіламі, развіваюцца ў дыяпазоне тэмператур ад 45°C да 122°C1, 2, 3, 4. Цеплафілы жывуць у розных экасістэмах, такіх як глыбакаводныя гідратэрмальныя крыніцы, гарачыя крыніцы або вулканічныя вобласці. Іх даследаванні выклікалі вялікую цікавасць за апошнія некалькі дзесяцігоддзяў па меншай меры па дзвюх прычынах. Па-першае, мы можам даведацца з іх, напрыклад, пра тое, як тэрмафілы 5, 6, ферменты 7, 8 і мембраны 9 стабільныя пры такіх высокіх тэмпературах, або як тэрмафілы могуць супрацьстаяць экстрэмальным узроўням радыяцыі10. Па-другое, яны з'яўляюцца асновай для многіх важных біятэхналагічных прыкладанняў1,11,12, такіх як вытворчасць паліва13,14,15,16, хімічны сінтэз (дыгідро, спірты, метан, амінакіслоты і г.д.)17, біяздабыча18 і тэрмастабільныя біякаталізатары7,11, 13. У прыватнасці, добра вядомая ў цяперашні час палімеразная ланцуговая рэакцыя (ПЦР)19 уключае фермент (палімеразу Taq), вылучаны з цеплалюбівай бактэрыі Thermus aquaticus, адной з першых выяўленых цеплалюбівых бактэрый.
Аднак вывучэнне цеплалюбівых людзей - задача няпростая, і яе нельга імправізаваць ні ў адной біялагічнай лабараторыі. У прыватнасці, жывых тэрмафілаў нельга назіраць in vitro з дапамогай стандартнага светлавога мікраскопа, нават з камерцыйна даступнымі награвальнымі камерамі, якія звычайна разлічаны на тэмпературу да 40°C. З 1990-х гадоў толькі некалькі даследчых груп прысвяцілі сябе ўкараненню сістэм высокатэмпературнай мікраскапіі (HTM). У 1994 г. Глух і інш. Камера нагрэву/ахалоджвання была задумана на аснове выкарыстання ячэйкі Пельцье, якая кантралюе тэмпературу прамавугольных капіляраў, закрытых для падтрымання анаэробнасці 20 . Прыладу можна награваць да 100 °C з хуткасцю 2 °C/с, што дазваляе аўтарам вывучаць рухомасць гіпертэрмафільнай бактэрыі Thermotoga maritima21. У 1999 Horn і соавт. Была распрацавана вельмі падобная прылада, якая ўсё яшчэ заснавана на выкарыстанні нагрэтых капіляраў, прыдатных для камерцыйнай мікраскапіі для вывучэння дзялення/злучэння клетак. Пасля доўгага перыяду адноснага бяздзейнасці пошук эфектыўных HTM аднавіўся ў 2012 годзе, у прыватнасці, у сувязі з серыяй работ групы Вірта, у якіх выкарыстоўвалася прылада, вынайдзеная Хорнам і інш. Пятнаццаць гадоў таму рухомасць вялікай колькасці архей, у тым ліку гіпертэрмафілаў, вывучалася пры тэмпературах да 100°C з дапамогай нагрэтых капіляраў23,24. Яны таксама змянілі арыгінальны мікраскоп, каб дасягнуць больш хуткага нагрэву (некалькі хвілін замест 35 хвілін, каб дасягнуць зададзенай тэмпературы) і дасягнуць лінейнага градыенту тэмпературы больш за 2 см па асяроддзі. Гэта прылада для фарміравання тэмпературнага градыенту (TGFD) выкарыстоўвалася для вывучэння рухомасці многіх тэрмафілаў у тэмпературных градыентах на біялагічна рэлевантных адлегласцях 24, 25.
Награванне замкнёных капіляраў - не адзіны спосаб назіраць жывых цеплалюбівых. У 2012 годзе Кувабара і інш. Выкарыстоўваліся самаробныя аднаразовыя камеры Pyrex, зачыненыя тэрмаўстойлівым клеем (Super X2; Cemedine, Японія). Узоры былі размешчаны на камерцыйна даступнай празрыстай награвальнай пласціне (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Японія), здольнай награвацца да 110°C, але першапачаткова не прызначанай для біявізуалізацыі. Аўтары назіралі эфектыўнае дзяленне анаэробных термофильных бактэрый (Thermosipho globiformans, час падваення 24 мін) пры 65°C. У 2020 годзе Pulshen et al. Эфектыўнае награванне камерцыйнага металічнага посуду (AttofluorTM, Thermofisher) было прадэманстравана з выкарыстаннем двух самаробных награвальных элементаў: вечка і падножкі (канфігурацыя, натхнёная машынай ПЦР). Гэта аб'яднанне прыводзіць да аднастайнай тэмпературы вадкасці і прадухіляе выпарэнне і кандэнсацыю ў ніжняй частцы вечка. Выкарыстанне ўшчыльняльнага кольца дазваляе пазбегнуць газаабмену з навакольным асяроддзем. Гэты HTM, які называецца Sulfoscope, выкарыстоўваўся для выявы Sulfolobus acidocaldarius пры 75°C27.
Прызнаным абмежаваннем усіх гэтых сістэм з'яўлялася абмежаванне на выкарыстанне паветраных аб'ектываў, любое апусканне ў алей было непрыдатным для такой высокай тэмпературы і для візуалізацыі праз празрыстыя ўзоры таўшчынёй >1 мм. Прызнаным абмежаваннем усіх гэтых сістэм з'яўлялася абмежаванне на выкарыстанне паветраных аб'ектываў, любое апусканне ў алей было непрыдатным для такой высокай тэмпературы і для візуалізацыі праз празрыстыя ўзоры таўшчынёй >1 мм. Агульнапрызнаным недахопам усіх гэтых сістэм было абмежаванае выкарыстанне паветраных аб'ектыў, паколькі любое апусканне ў алей не падыходзіла для такой высокай тэмпературы і для візуалізацыі праз празрыстыя ўзоры таўшчынёй > 1 мм. Прызнаным недахопам усіх гэтых сістэм было абмежаванне выкарыстання паветраных аб'ектываў, паколькі любое апусканне ў алей не было прыдатным для такой высокай тэмпературы і для візуалізацыі праз празрыстыя ўзоры таўшчынёй больш за 1 мм.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1毫米厚的透明样品成像。 Прызнаным абмежаваннем усіх гэтых сістэм з'яўляецца абмежаванне выкарыстання люстэрка з паветраным уцягваннем, паколькі любое апусканне ў алей непрыдатна для адлюстравання празрыстых узораў таўшчынёй больш за 1 мм пры такіх высокіх тэмпературах. Агульнапрызнаным недахопам усіх гэтых сістэм з'яўляецца абмежаванае выкарыстанне паветраных аб'ектыў, любое апусканне ў алей, непрыдатнае для такіх высокіх тэмператур, і візуалізацыя праз празрыстыя ўзоры таўшчынёй >1 мм. Прызнаным недахопам усіх гэтых сістэм з'яўляецца абмежаванае выкарыстанне паветраных лінзаў, любая алейная иммерсия непрыдатная для такіх высокіх тэмператур і візуалізацыі праз празрыстыя ўзоры таўшчынёй >1 мм.Зусім нядаўна гэта абмежаванне было знята Чарльзам-Орзагам і соавт. 28, які распрацаваў прыладу, якая больш не забяспечвае цяпло вакол сістэмы, якая цікавіць, а ўнутры самога покрыўнага шкла, пакрытага тонкім празрыстым пластом рэзістара з ITO (аксіду індыя і волава). Вечка можа быць нагрэта да 75 °C шляхам прапускання электрычнага току праз празрысты пласт. Аднак аўтар таксама павінен нагрэць лінзу да аб'ектыва, але не больш за 65 °C, каб не пашкодзіць яе.
Гэтыя працы паказваюць, што распрацоўка эфектыўнай высокатэмпературнай аптычнай мікраскапіі не атрымала шырокага распаўсюджвання, часта патрабуе самаробнага абсталявання і часта дасягаецца коштам прасторавага дазволу, што з'яўляецца сур'ёзным недахопам, улічваючы, што цеплалюбівыя мікраарганізмы не перавышаюць некалькі памераў мікраметры. Зніжэнне аб'ёму нагрэву з'яўляецца ключом да вырашэння трох неад'емных праблем HTM: дрэннага прасторавага раздзялення, высокай цеплавой інэрцыі пры награванні сістэмы і шкоднага нагрэву навакольных элементаў (іммерсійнага алею, аб'ектыва… або рук карыстальніка) пры экстрэмальных тэмпературах. ).
У гэтым артыкуле мы прадстаўляем HTM для тэрмафільных назіранняў, які не заснаваны на рэзістыўным награванні. Замест гэтага мы дамагліся лакалізаванага нагрэву ў абмежаванай вобласці поля зроку мікраскопа з дапамогай лазернага апраменьвання святлопаглынальнай падкладкі. Размеркаванне тэмпературы візуалізавалі з дапамогай колькаснай фазавай мікраскапіі (QPM). Эфектыўнасць гэтага метаду дэманструюць Geobacillus stearothermophilus, рухомая цеплалюбівая бактэрыя, якая размнажаецца пры тэмпературы каля 65 °C і мае кароткі час падваення (каля 20 хвілін), і Sulfolobus shibatae, гіпертэрмафіл, які аптымальна расце пры 80 °C (археі) праілюстраваць. Нармальная хуткасць рэплікацыі і плаванне назіраліся ў залежнасці ад тэмпературы. Гэты лазер HTM (LA-HTM) не абмежаваны таўшчынёй покрыўнага шкла або характарам аб'ектыва (апусканне ў паветра або алей). Гэта дазваляе выкарыстоўваць любы аб'ектыў з высокім дазволам на рынку. Ён таксама не пакутуе ад павольнага нагрэву з-за цеплавой інэрцыі (дасягае імгненнага нагрэву ў маштабе мілісекунд) і выкарыстоўвае толькі камерцыйна даступныя кампаненты. Адзіныя новыя праблемы бяспекі звязаны з прысутнасцю магутных лазерных прамянёў (як правіла, да 100 мВт) унутры прылады і, магчыма, праз вочы, для чаго патрэбныя ахоўныя акуляры.
Прынцып LA-HTM заключаецца ў выкарыстанні лазера для лакальнага нагрэву ўзору ў полі зроку мікраскопа (мал. 1а). Для гэтага ўзор павінен быць святлопаглынальным. Каб выкарыстоўваць разумную магутнасць лазера (менш за 100 мВт), мы не спадзяваліся на паглынанне святла вадкай асяроддзем, а штучна павялічылі паглынанне ўзору, пакрыўшы падкладку наначасціцамі золата (мал. 1с). Награванне наначасціц золата святлом мае фундаментальнае значэнне для вобласці цеплавой плазмонікі з магчымым прымяненнем у біямедыцыне, нанахіміі або зборы сонечнага святла29,30,31. За апошнія некалькі гадоў мы выкарыстоўвалі гэты LA-HTM у некалькіх даследаваннях, звязаных з прымяненнем цеплавой плазмы ў фізіцы, хіміі і біялогіі. Асноўная цяжкасць гэтага метаду заключаецца ў адлюстраванні канчатковага профілю тэмпературы, так як падвышаная тэмпература абмежаваная мікрамаштабнай вобласцю ўнутры ўзору. Мы паказалі, што адлюстраванне тэмпературы можа быць дасягнута з дапамогай інтэрферометра папярочнага зруху з чатырма даўжынямі хваль, простага, высокараздзяляльнага і вельмі адчувальнага метаду колькаснай фазавай мікраскапіі, заснаванага на выкарыстанні двухмерных дыфракцыйных рашотак (таксама вядомых як папярочныя рашоткі). 33,34,35,36. Надзейнасць гэтага метаду тэрмічнай мікраскапіі, заснаванага на мікраскапіі хвалевага фронту са скрыжаванай рашоткай (CGM), была прадэманстравана ў тузіне артыкулаў, апублікаваных за апошняе дзесяцігоддзе37,38,39,40,41,42,43.
Схема ўстаноўкі паралельнага лазернага награвальнага, фармовачнага і тэмпературнага мікраскопа. b Геаметрыя ўзору, якая складаецца з камеры AttofluorTM, якая змяшчае покрыўнае шкло, пакрытае наначасціцамі золата. c Уважліва паглядзіце на ўзор (не ў маштабе). d ўяўляе раўнамерны профіль лазернага прамяня і (е) змадэляванае наступнае размеркаванне тэмпературы на плоскасці ўзору наначасціц золата. f - кальцавой профіль лазернага прамяня, прыдатны для стварэння аднастайнай тэмпературы, як паказана ў мадэляванні выніковага размеркавання тэмпературы, паказанага ў (g). Шкала: 30 мкм.
У прыватнасці, мы нядаўна дасягнулі нагрэву клетак млекакормячых з дапамогай LA-HTM і CGM і адсочвалі рэакцыі клеткавага цеплавога шоку ў дыяпазоне 37-42°C, дэманструючы прыдатнасць гэтай методыкі для візуалізацыі асобных жывых клетак. Аднак прымяненне LA-HTM для вывучэння мікраарганізмаў пры высокіх тэмпературах не адназначна, бо патрабуе большай асцярожнасці ў параўнанні з клеткамі млекакормячых: па-першае, нагрэў дна асяроддзя на дзесяткі градусаў (а не на некалькі градусаў) прыводзіць да да моцнага вертыкальнага градыенту тэмпературы. можа ствараць канвекцыю вадкасці 44, якая, калі не будзе моцна прымацавана да падкладкі, можа выклікаць непажаданае перамяшчэнне і змешванне бактэрый. Гэтую канвекцыю можна ліквідаваць, паменшыўшы таўшчыню пласта вадкасці. Для гэтай мэты ва ўсіх эксперыментах, прадстаўленых ніжэй, бактэрыяльныя завісі змяшчалі паміж двума покрыўнымі шкламі таўшчынёй прыкладна 15 мкм, змешчанымі ўнутры металічнага кубка (AttofluorTM, Thermofisher, мал. 1b,c). У прынцыпе, канвекцыі можна пазбегнуць, калі таўшчыня вадкасці менш памеру прамяня награвальнага лазера. Па-другое, праца ў такой абмежаванай геаметрыі можа задушыць аэробныя арганізмы (гл. мал. S2). Гэтай праблемы можна пазбегнуць, выкарыстоўваючы падкладку, пранікальную для кіслароду (ці любога іншага жыццёва важнага газу), пакідаючы захопленыя бурбалкі паветра ўнутры покрыўнага шкла або прасвідроўваючы адтуліны ў верхнім покрыўным шкле (гл. мал. S1) 45 . У гэтым даследаванні мы абралі апошняе рашэнне (малюнкі 1b і S1). Нарэшце, лазерны нагрэў не забяспечвае раўнамернага размеркавання тэмпературы. Нават пры той жа інтэнсіўнасці лазернага прамяня (мал. 1d) размеркаванне тэмпературы не з'яўляецца раўнамерным, а хутчэй нагадвае размеркаванне Гаўса з-за цеплавой дыфузіі (мал. 1e). Калі мэта складаецца ў тым, каб усталяваць дакладныя тэмпературы ў полі зроку для вывучэння біялагічных сістэм, няроўныя профілі не з'яўляюцца ідэальнымі і могуць таксама прывесці да тэрмафорэтычнага руху бактэрый, калі яны не прыліпаюць да падкладкі (гл. мал. S3, S4)39. З гэтай мэтай мы выкарыстоўвалі прасторавы мадулятар святла (SLM), каб сфармаваць інфрачырвоны лазерны прамень у адпаведнасці з формай кольцы (мал. 1f) у плоскасці ўзору, каб дасягнуць ідэальна раўнамернага размеркавання тэмпературы ў дадзенай геаметрычнай вобласці, нягледзячы на цеплавую дыфузію (мал. 1d) 39, 42, 46. Змесціце верхняе покрыўнае шкло на металічны посуд (малюнак 1b), каб пазбегнуць выпарэння асяроддзя, і назірайце як мінімум некалькі дзён. Паколькі гэта верхняе покрыўнае шкло не запячатана, пры неабходнасці ў любы час можна лёгка дадаць дадатковую сераду.
Каб праілюстраваць, як працуе LA-HTM, і прадэманстраваць яго прымяненне ў тэрмафільных даследаваннях, мы вывучылі аэробныя бактэрыі Geobacillus stearothermophilus, якія маюць аптымальную тэмпературу росту каля 60-65°C. Бактэрыя таксама мае жгуцікі і здольнасць плаваць, забяспечваючы яшчэ адзін паказчык нармальнай клеткавай актыўнасці.
Узоры (мал. 1b) папярэдне инкубировали пры 60°C на працягу адной гадзіны, а затым змяшчалі ў трымальнік для ўзору LA-HTM. Гэтая папярэдняя інкубацыя неабавязковая, але ўсё ж карысная па дзвюх прычынах: па-першае, калі лазер уключаны, клеткі неадкладна пачынаюць расці і дзяліцца (гл. фільм M1 у дадатковых матэрыялах). Без папярэдняй інкубацыі рост бактэрый звычайна затрымліваецца прыкладна на 40 хвілін кожны раз, калі на ўзоры награваецца новая зона агляду. Па-другое, 1-гадзінная папярэдняя інкубацыя спрыяла адгезіі бактэрый да покрыўнага шкла, прадухіляючы дрэйф клетак з поля зроку з-за тэрмафарэзу пры ўключэнні лазера (гл. фільм M2 у дадатковых матэрыялах). Тэрмафарэз - гэта рух часціц або малекул уздоўж тэмпературнага градыенту, звычайна ад гарачага да халоднага, і бактэрыі не з'яўляюцца выключэннем43,47. Гэты непажаданы эфект ліквідуецца на дадзенай плошчы з дапамогай SLM для фарміравання лазернага прамяня і дасягнення роўнага размеркавання тэмпературы.
На мал. На малюнку 2 паказана размеркаванне тэмпературы, вымеранае CGM, атрыманае пры апраменьванні шкляной падкладкі, пакрытай наначасціцамі золата, кальцавым лазерным прамянём (мал. 1f). Назіралася плоскае размеркаванне тэмпературы па ўсёй плошчы, ахопленай лазерным прамянём. У гэтай зоне ўстаноўлена 65°C, аптымальная тэмпература росту. Па-за гэтай вобласцю тэмпературная крывая натуральна апускаецца да \(1/r\) (дзе \(r\) - радыяльная каардыната).
Тэмпературная карта вымярэнняў CGM, атрыманая з дапамогай кальцавога лазернага прамяня для апраменьвання пласта наначасціц золата для атрымання плоскага профілю тэмпературы на круглай вобласці. б Ізатэрма карты тэмператур (а). Контур лазернага прамяня прадстаўлены шэрым пункцірным кругам. Эксперымент паўтаралі двойчы (гл. Дадатковыя матэрыялы, малюнак S4).
Жыццяздольнасць бактэрыяльных клетак кантралявалі на працягу некалькіх гадзін з дапамогай LA-HTM. На мал. 3 паказвае інтэрвал часу для чатырох малюнкаў, зробленых з 3-гадзіннага 20-хвіліннага фільма (фільм M3, дадатковая інфармацыя). Было заўважана, што бактэрыі актыўна размнажаюцца ў кругавой вобласці, вызначанай лазерам, дзе тэмпература была аптымальнай, набліжаючыся да 65°C. Наадварот, рост клетак значна зніжаўся, калі тэмпература апускалася ніжэй за 50 ° C на працягу 10 секунд.
Выявы аптычнай глыбіні бактэрый G. stearothermophilus, якія растуць пасля лазернага нагрэву ў розны час, (a) t = 0 мін, (b) 1 гадзіна 10 мін, (c) 2 гадзіны 20 мін, (d) 3 гадзіны 20 мін, па-за 200 Вынята з аднахвіліннага фільма (плёнка M3, прадстаўленая ў дадатковай інфармацыі), накладзенага на адпаведную тэмпературную карту. Лазер уключаецца ў час \(t=0\). Да выявы інтэнсіўнасці дададзены ізатэрмы.
Для далейшай колькаснай ацэнкі росту клетак і яго залежнасці ад тэмпературы мы вымералі павелічэнне біямасы розных калоній першапачаткова ізаляваных бактэрый у полі зроку Movie M3 (мал. 4). Бактэрыі-бацькі, выбраныя ў пачатку фарміравання міні-калоніеўтваральнай адзінкі (mCFU), паказаны на малюнку S6. Вымярэнні сухой масы праводзіліся з дапамогай камеры CGM 48, якая выкарыстоўвалася для адлюстравання размеркавання тэмпературы. Здольнасць CGM вымяраць сухую вагу і тэмпературу з'яўляецца моцным бокам LA-HTM. Як і чакалася, высокая тэмпература выклікала больш хуткі рост бактэрый (мал. 4а). Як паказана на паўлагарычным графіку на мал. 4b, рост пры ўсіх тэмпературах ідзе за экспанентным ростам, дзе даныя выкарыстоўваюць экспанентную функцыю \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), дзе \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – час генерацыі (або час падваення), \( g =1/ \tau\) – хуткасць росту (колькасць дзяленняў у адзінку часу). На мал. 4c паказвае адпаведную хуткасць росту і час генерацыі ў залежнасці ад тэмпературы. Хутка растучыя mCFU характарызуюцца насычэннем росту праз дзве гадзіны, чаканым паводзінам з-за высокай шчыльнасці бактэрый (падобна стацыянарнай фазе ў класічных вадкіх культурах). Агульная форма \(g\злева(T\справа)\) (мал. 4c) адпавядае чаканай двухфазнай крывой для G. stearothermophilus з аптымальнай хуткасцю росту каля 60-65°C. Супастаўце даныя з дапамогай кардынальнай мадэлі (малюнак S5)49, дзе \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, што добра ўзгадняецца з іншымі значэннямі, прыведзенымі ў літаратуры49. Хоць параметры, якія залежаць ад тэмпературы, узнаўляюцца, максімальная хуткасць росту \({G}_{0}\) можа вар'іравацца ад аднаго эксперыменту да іншага (гл. малюнкі S7-S9 і фільм M4). У адрозненне ад тэмпературных параметраў, якія павінны быць універсальнымі, максімальная хуткасць росту залежыць ад уласцівасцяў асяроддзя (даступнасць пажыўных рэчываў, канцэнтрацыя кіслароду) у межах назіранай геаметрыі мікрамаштабу.
рост мікробаў пры розных тэмпературах. mCFU: мініяцюрныя адзінкі, якія ўтвараюць калоніі. Дадзеныя, атрыманыя з відэазапісу адной бактэрыі, якая расце ў тэмпературным градыенце (фільм M3). b Тое ж, што (a), паўлагарыфмічная шкала. c Хуткасць росту\(\tau\) і час генерацыі\(g\), разлічаныя з дапамогай лінейнай рэгрэсіі (b). Гарызантальныя паласы памылак: тэмпературны дыяпазон, у якім mCFU пашыраюцца ў поле зроку падчас росту. Вертыкальныя паласы памылак: стандартная памылка лінейнай рэгрэсіі.
У дадатак да нармальнага росту некаторыя бактэрыі часам з'яўляліся ў поле зроку падчас лазернага нагрэву, што з'яўляецца чаканым паводзінам бактэрый са жгуцікамі. Фільм M5 у дадатковай інфармацыі паказвае такія заняткі плаваннем. У гэтым эксперыменце раўнамернае лазернае выпраменьванне выкарыстоўвалася для стварэння тэмпературнага градыенту, як паказана на малюнках 1d, e і S3. На малюнку 5 паказаны дзве паслядоўнасці малюнкаў, выбраных з фільма M5, якія паказваюць, што адна бактэрыя дэманструе накіраванае рух, а ўсе астатнія бактэрыі застаюцца нерухомымі.
Дзве часовыя рамкі (а) і (б) паказваюць плаванне дзвюх розных бактэрый, пазначаных пункцірнымі кружкамі. Выявы былі ўзяты з фільма M5 (прадастаўлены ў якасці дадатковага матэрыялу).
У выпадку G. stearothermophilus актыўны рух бактэрый (мал. 5) пачыналася праз некалькі секунд пасля ўключэння лазернага прамяня. Гэта назіранне падкрэслівае часовую рэакцыю гэтага цеплалюбівых мікраарганізмаў на павышэнне тэмпературы, як гэта ўжо было заўважана Mora et al. 24 . Тэма рухомасці бактэрый і нават тэрматаксісу можа быць дадаткова вывучана з дапамогай LA-HTM.
Мікробнае плаванне не варта блытаць з іншымі тыпамі фізічнага руху, а менавіта (i) броўнаўскім рухам, які выглядае як хаатычны рух без пэўнага кірунку, (ii) канвекцыяй 50 і тэрмафарэзам 43, якія складаюцца з рэгулярнага дрэйфу руху ўздоўж тэмпературы. градыент.
G. stearothermophilus вядомы сваёй здольнасцю вырабляць вельмі ўстойлівыя спрэчкі (утварэнне спрэчка) пры ўздзеянні неспрыяльных умоў навакольнага асяроддзя ў якасці абароны. Калі ўмовы навакольнага асяроддзя зноў становяцца спрыяльнымі, спрэчкі прарастаюць, утвараючы жывыя клеткі і аднаўляючы рост. Хоць гэты працэс спороношения/прарастання добра вядомы, ён ніколі не назіраўся ў рэальным часе. Выкарыстанне LA-HTM, мы паведамляем тут першае назіранне прарастання падзей у G. stearothermophilus.
На мал. 6а паказаны пакадравыя выявы аптычнай глыбіні (OT), атрыманыя з выкарыстаннем набору CGM з 13 спрэчка. За ўвесь час збору (15 гадзін 6 хвілін, \(t=0\) – пачатак лазернага нагрэву) 4 з 13 спор прараслі, у паслядоўныя моманты часу \(t=2\) гадзін, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' і \(11\) h \(30\)'. Хоць на малюнку 6 паказана толькі адна з гэтых падзей, у дадатковым матэрыяле ў фільме M6 можна назіраць 4 падзеі прарастання. Цікава, што прарастанне аказваецца выпадковым: не ўсе спрэчкі прарастаюць і не прарастаюць адначасова, нягледзячы на аднолькавыя змены ўмоў навакольнага асяроддзя.
Пакадравая здымка, якая складаецца з 8 здымкаў OT (масляная імерсія, 60x, аб'ектыў 1,25 NA) і (b) эвалюцыя біямасы агрэгатаў G. stearothermophilus. c (b) намалявана ў полулогарифмическом маштабе, каб падкрэсліць лінейнасць хуткасці росту (пункцірная лінія).
На мал. 6b,c паказвае біямасу клеткавых папуляцый у поле зроку ў залежнасці ад часу за ўвесь перыяд збору дадзеных. Хуткі распад сухой масы, які назіраецца пры \(t=5\)h на мал. 6б, в, за кошт выхаду некаторых клетак з поля зроку. Хуткасць росту гэтых чатырох падзей складае \(0,77\pm 0,1\) г-1. Гэта значэнне вышэй, чым хуткасць росту, звязаная з малюнкам 3. 3 і 4, дзе клеткі растуць нармальна. Прычына павелічэння хуткасці росту G. stearothermophilus са спрэчка незразумелая, але гэтыя вымярэнні падкрэсліваюць цікавасць LA-HTM і працуюць на ўзроўні адной клеткі (або на ўзроўні адной mCFU), каб даведацца больш пра дынаміку жыцця клеткі. .
Каб дадаткова прадэманстраваць універсальнасць LA-HTM і яго эфектыўнасць пры высокіх тэмпературах, мы даследавалі рост Sulfolobus shibatae, гіпертэрмафільнай ацыдафільнай археі з аптымальнай тэмпературай росту 80°C51. У параўнанні з G. stearothermophilus, гэтыя археі таксама маюць зусім іншую марфалогію, нагадваючы шары памерам 1 мікрон (кокі), а не падоўжаныя палачкі (бацылы).
Малюнак 7a складаецца з паслядоўных малюнкаў аптычнай глыбіні S. shibatae mCFU, атрыманых з дапамогай CGM (гл. мастацкі фільм M7 у Дадатковых матэрыялах). Гэта mCFU расце пры тэмпературы каля 73°C, што ніжэй за аптымальную тэмпературу 80°C, але знаходзіцца ў дыяпазоне тэмператур для актыўнага росту. Мы назіралі некалькі падзей дзялення, якія праз некалькі гадзін рабілі mCFU падобнымі на вінаградныя вінаградныя ягады архей. З гэтых здымкаў OT біямаса mCFU была вымерана з цягам часу і прадстаўлена на малюнку 7b. Цікава, што mCFU S. shibatae паказалі лінейны рост, а не экспанентны рост, які назіраецца з mCFU G. stearothermophilus. Вялася даўняя дыскусія 52 аб прыродзе хуткасці росту клетак: у той час як некаторыя даследаванні паведамляюць пра хуткасць росту мікробаў, прапарцыйную іх памеру (экспанентны рост), іншыя паказваюць пастаянную хуткасць (лінейны або білінейны рост). Як патлумачылі Цур і інш.53, адрозненне паміж экспанентным і (бі)лінейным ростам патрабуе дакладнасці <6% у вымярэннях біямасы, што недаступна для большасці метадаў QPM, нават з удзелам інтэрфераметрыі. Як патлумачылі Цур і інш.53, адрозненне паміж экспанентным і (бі)лінейным ростам патрабуе дакладнасці <6% у вымярэннях біямасы, што недаступна для большасці метадаў QPM, нават з удзелам інтэрфераметрыі. Як патлумачылі Кур і др.53, адрозненне экспаненцыяльнага і (бі)лінейнага росту патрабуе дакладнасці <6% у вымярэннях біямасы, што недаступна для большасці метадаў QPM, нават з выкарыстаннем інтэрфераметрыі. Як патлумачылі Зур і інш.53, адрозненне паміж экспанентным і (бі)лінейным ростам патрабуе <6% дакладнасці вымярэнняў біямасы, што недасяжна для большасці метадаў QPM, нават з выкарыстаннем інтэрфераметрыі.Як патлумачылі Zur et al. 53, адрозненне паміж экспанентным і (бі)лінейным ростам патрабуе менш за 6% дакладнасці вымярэнняў біямасы, што недасягальна для большасці метадаў QPM, нават калі выкарыстоўваецца інтэрфераметрыя. CGM дасягае такой дакладнасці з дакладнасцю ніжэй за пг пры вымярэннях біямасы36,48.
Пакадравая здымка, якая складаецца з 6 здымкаў OT (масляная імерсія, 60x, NA аб'ектыўная 1,25) і (b) эвалюцыя біямасы мікра-КОЕ, вымераная з дапамогай CGM. Для атрымання дадатковай інфармацыі глядзіце фільм M7.
Ідэальна лінейны рост S. shibatae быў нечаканым і пакуль не паведамлялася. Аднак чакаецца экспанентны рост, хаця б таму, што з цягам часу павінна адбыцца шматразовае дзяленне 2, 4, 8, 16 … клетак. Мы выказалі здагадку, што лінейны рост можа быць звязаны з інгібіраваннем клетак з-за шчыльнай упакоўкі клетак, гэтак жа як рост клетак запавольваецца і ў канчатковым выніку дасягае стану спакою, калі шчыльнасць клетак занадта высокая.
У заключэнне мы абмяркуем па чарзе наступныя пяць цікавых момантаў: памяншэнне аб'ёму нагрэву, памяншэнне цеплавой інэрцыі, цікавасць да наначасціц золата, цікавасць да колькаснай фазавай мікраскапіі і магчымы дыяпазон тэмператур, у якім можна выкарыстоўваць LA-HTM.
У параўнанні з рэзістыўным нагрэвам, лазерны нагрэў, які выкарыстоўваецца для распрацоўкі HTM, дае некалькі пераваг, якія мы праілюструем у гэтым даследаванні. У прыватнасці, у вадкіх асяроддзях у поле зроку мікраскопа награвальны аб'ём захоўваецца ў межах некалькіх (10 мкм) 3 аб'ёмаў. Такім чынам, толькі назіраныя мікробы актыўныя, у той час як іншыя бактэрыі знаходзяцца ў стане спакою і могуць быць выкарыстаны для далейшага вывучэння ўзору - няма неабходнасці мяняць узор кожны раз, калі трэба праверыць новую тэмпературу. Акрамя таго, нагрэў у мікрамаштабе дазваляе непасрэдна даследаваць шырокі дыяпазон тэмператур: малюнак 4c быў атрыманы з 3-гадзіннага фільма (фільм M3), які звычайна патрабуе падрыхтоўкі і даследавання некалькіх узораў - па адным для кожнага з даследуемых узораў. y - тэмпература, якая ўяўляе колькасць дзён у эксперыменце. Памяншэнне нагрэтага аб'ёму таксама падтрымлівае ўсе навакольныя аптычныя кампаненты мікраскопа, асабліва лінзу аб'ектыва, пры пакаёвай тэмпературы, што з'яўлялася сур'ёзнай праблемай, з якой да гэтага часу сутыкалася супольнасць. LA-HTM можа выкарыстоўвацца з любымі аб'ектывамі, у тым ліку алейнымі імерсійнымі, і будзе заставацца пры пакаёвай тэмпературы нават пры экстрэмальных тэмпературах у полі зроку. Асноўнае абмежаванне метаду лазернага нагрэву, пра якое мы паведамляем у гэтым даследаванні, заключаецца ў тым, што клеткі, якія не прыліпаюць або не ўсплываюць, могуць знаходзіцца далёка ад поля зроку і іх цяжка вывучыць. Абыходным шляхам можа быць выкарыстанне лінзаў з малым павелічэннем для дасягнення большага павышэння тэмпературы, якое перавышае некалькі сотняў мікрон. Гэтая асцярожнасць суправаджаецца памяншэннем прасторавага дазволу, але калі мэтай з'яўляецца вывучэнне руху мікраарганізмаў, высокае прасторавае дазвол не патрабуецца.
Шкала часу для нагрэву (і астуджэння) сістэмы \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) залежыць ад яе памеру, па законе \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), дзе \ (L\ ) — характэрны памер крыніцы цяпла (дыяметр лазернага прамяня ў нашым даследаванні \(L\ каля 100\) мкм), \(D\) — каэфіцыент цеплаправоднасці асяроддзя (сярэдні ў нашым корпус, шкло і вада. Хуткасць дыфузіі\(D\прыкладна 2\кратная {10}^{-7}\) м2/с. Такім чынам, у гэтым даследаванні час водгуку парадку 50 мс, г.зн. квазіімгненны). Гэта імгненнае ўсталяванне павышэння тэмпературы не толькі скарачае працягласць эксперыменту, але таксама дазваляе дакладна вызначыць час \(t=0\) для любога дынамічнага даследавання тэмпературных эфектаў.
Прапанаваны намі метад дастасавальны да любой святлопаглынальнай падкладцы (напрыклад, камерцыйным узорам з пакрыццём ITO). Аднак наначасціцы золата здольныя забяспечваць высокае паглынанне ў інфрачырвоным дыяпазоне і нізкае паглынанне ў бачным дыяпазоне, апошнія характарыстыкі якіх уяўляюць цікавасць для эфектыўнага аптычнага назірання ў бачным дыяпазоне, асабліва пры выкарыстанні флуарэсцэнцыі. Акрамя таго, золата біясумяшчальнае, хімічна інэртнае, аптычную шчыльнасць можна рэгуляваць ад 530 нм да блізкага інфрачырвонага дыяпазону, а падрыхтоўка ўзораў простая і эканамічная29.
Мікраскапія хвалевага фронту папярочнай рашоткі (CGM) дазваляе не толькі складаць карту тэмпературы ў мікрамаштабе, але і праводзіць маніторынг біямасы, што робіць яе асабліва карыснай (калі не неабходнай) у спалучэнні з LA-HTM. За апошняе дзесяцігоддзе былі распрацаваны іншыя метады тэмпературнай мікраскапіі, асабліва ў галіне біявізуалізацыі, і большасць з іх патрабуе выкарыстання адчувальных да тэмпературы флуоресцентных зондаў54,55. Аднак гэтыя метады падвяргаюцца крытыцы, і ў некаторых справаздачах вымяраюцца нерэалістычныя змены тэмпературы ўнутры клетак, магчыма, з-за таго, што флуарэсцэнцыя залежыць ад шматлікіх фактараў, акрамя тэмпературы. Акрамя таго, большасць флуарэсцэнтных зондаў нестабільныя пры высокіх тэмпературах. Такім чынам, QPM і, у прыватнасці, CGM уяўляюць сабой ідэальны метад тэмпературнай мікраскапіі для вывучэння жыцця пры высокіх тэмпературах з дапамогай аптычнай мікраскапіі.
Даследаванні S. shibatae, якія аптымальна жывуць пры тэмпературы 80°C, паказваюць, што LA-HTM можа прымяняцца для вывучэння гіпертэрмафілаў, а не толькі простых цеплафілаў. У прынцыпе, дыяпазон тэмператур, які можа быць дасягнуты з выкарыстаннем LA-HTM, не мае абмежаванняў, і нават тэмпература вышэй за 100°C можа быць дасягнута пры атмасферным ціску без кіпячэння, як прадэманстравала наша група з 38 чалавек у гідратэрмальнай хіміі пры атмасферным ціск А. Для награвання наначасціц золата 40 такім жа чынам выкарыстоўваецца лазер. Такім чынам, LA-HTM можа быць выкарыстаны для назірання за беспрэцэдэнтнымі гіпертэрмафіламі з дапамогай стандартнай аптычнай мікраскапіі з высокім разрозненнем у стандартных умовах (г.зн. пры стрэсе навакольнага асяроддзя).
Усе эксперыменты праводзіліся з выкарыстаннем самаробнага мікраскопа, уключаючы асвятленне Кёлера (са святлодыёдам, M625L3, Thorlabs, 700 мВт), трымальнік для ўзору з ручным рухам xy, аб'ектывы (Olympus, 60x, 0,7 NA, паветра, LUCPlanFLN60X або 60x, 1,25 NA, алей , UPLFLN60XOI), камера CGM (крыжаваная рашотка QLSI, крок 39 мкм, 0,87 мм ад датчыка камеры Andor Zyla) для атрымання інтэнсіўнасці і візуалізацыі хвалевага фронту і камера sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, 16-бітны рэжым ад Hamamatsu) для запісу дадзеныя паказаны на малюнку 5 (бактэрыяльнае плаванне). Дыхроічны раздзяляльнік прамяня - гэта край BrightLine з даўжынёй даўжыні 749 нм (Semrock, FF749-SDi01). Фільтр на пярэдняй частцы камеры ўяўляе сабой фільтр кароткага праходу 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Тытанава-сапфіравы лазер (лазер Verdi G10, 532 нм, 10 Вт, лазерная паражніна цунамі з напампоўкай, Spectra-Physics на мал. 2-5, далей заменены на лазер Millenia, Spectraphysics 10 Вт, лазерная паражніна Mira з напампоўкай, Coherent, для мал. 2 -5). 6 і 7) усталяваны на даўжыню хвалі \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) нм, што адпавядае спектру плазмоннага рэзанансу наначасціц золата. Прасторавыя мадулятары святла (1920 × 1152 пікселя былі набыты ў Meadowlark Optics, разлічаныя па алгарытме Герхберга-Сакстона.
Мікраскапія хвалевага фронту крыжаванай рашоткі (CGM) - гэта метад аптычнай мікраскапіі, заснаваны на аб'яднанні двухмернай дыфракцыйнай рашоткі (таксама вядомай як крыжаваная рашотка) на адлегласці аднаго міліметра ад датчыка звычайнай камеры. Самы распаўсюджаны прыклад CGM, які мы выкарыстоўвалі ў гэтым даследаванні, называецца чатыроххвалевым інтэрферометрам з папярочным зрухам (QLSI), дзе папярочная рашотка складаецца з інтэнсіўнасці/фазы ў шахматным парадку, уведзенай і запатэнтаванай Primot et al. у 200034 г. Вертыкальныя і гарызантальныя лініі рашоткі ствараюць сеткападобныя цені на датчыку, скажэнні якіх можна лікава апрацаваць у рэальным часе, каб атрымаць аптычнае скажэнне хвалевага фронту (ці эквівалентны профіль фазы) падаючага святла. Пры выкарыстанні на мікраскопе камера CGM можа адлюстроўваць розніцу аптычнага ходу аб'екта на выяве, таксама вядомую як аптычная глыбіня (OT), з адчувальнасцю парадку нанаметраў36. У любым вымярэнні CGM, каб ліквідаваць любыя дэфекты ў аптычных кампанентах або прамянях, першасны эталонны OT малюнак павінен быць зроблены і адняты з любых наступных малюнкаў.
Тэмпературная мікраскапія была праведзена з выкарыстаннем камеры CGM, як апісана ў спасылцы. 32. Карацей кажучы, награванне вадкасці змяняе яе паказчык праламлення, ствараючы эфект цеплавой лінзы, якая скажае падаючы прамень. Гэта скажэнне хвалевага фронту вымяраецца CGM і апрацоўваецца з дапамогай алгарытму дэканвалюцыі для атрымання трохмернага размеркавання тэмпературы ў вадкім асяроддзі. Калі наначасціцы золата раўнамерна размеркаваны па ўзоры, картаванне тэмпературы можа быць зроблена ў зонах без бактэрый, каб атрымаць лепшыя выявы, што мы часам і робім. Эталонны малюнак CGM быў атрыманы без нагрэву (з выключаным лазерам), а затым зроблены ў тым жа месцы на малюнку з уключаным лазерам.
Вымярэнне сухой масы дасягаецца з дапамогай той жа камеры CGM, якая выкарыстоўваецца для візуалізацыі тэмпературы. Эталонныя выявы CGM былі атрыманы шляхам хуткага перамяшчэння ўзору па x і y падчас экспазіцыі ў якасці сродку асераднення любой неаднароднасці ў OT з-за прысутнасці бактэрый. З OT малюнкаў бактэрый, іх біямаса была атрымана з дапамогай ансамбля малюнкаў па абласцях, выбраных з дапамогай самаробнага алгарытму сегментацыі Matlab (гл. падраздзел «Лікавы код»), пасля працэдуры, апісанай у спас. 48. Карацей кажучы, мы выкарыстоўваем стаўленне \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), дзе \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) — відарыс аптычнай глыбіні, \(m\) — сухая маса і \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) з'яўляецца канстантай. Мы выбралі \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) мкм3/пг, што з'яўляецца тыповай канстантай для жывых клетак.
Покрыўнае шкло дыяметрам 25 мм і таўшчынёй 150 мкм, пакрытае наначасціцамі золата, было змешчана ў камеру AttofluorTM (Thermofisher) наначасціцамі золата ўверх. Geobacillus stearothermophilus папярэдне культывавалі на ноч у асяроддзі LB (200 абаротаў у хвіліну, 60°C) перад кожным днём эксперыментаў. Кроплю 5 мкл завісі G. stearothermophilus з аптычнай шчыльнасцю (OD) ад 0,3 да 0,5 наносілі на покрыўнае шкло з наначасціц золата. Затым на кроплю апускалі круглае покрыўнае шкло дыяметрам 18 мм з адтулінай дыяметрам 5 мм у цэнтры і паўторна наносілі на цэнтр адтуліны 5 мкл бактэрыяльнай завісі з такой жа аптычнай шчыльнасцю. Лункі на покрыўных шклах былі падрыхтаваны ў адпаведнасці з працэдурай, апісанай у працы. 45 (для атрымання дадатковай інфармацыі гл. Дадатковую інфармацыю). Затым дадайце 1 мл асяроддзя LB на покрыўнае шкло, каб прадухіліць высыханне пласта вадкасці. Апошняе покрыўнае шкло змяшчаецца на закрытую вечка камеры Attofluor™, каб прадухіліць выпарэнне асяроддзя падчас інкубацыі. Для эксперыментаў па прарастанні мы выкарыстоўвалі спрэчкі, якія пасля звычайных эксперыментаў часам пакрывалі верхняе покрыва. Падобным метадам быў атрыманы Sulfolobus shibatae. Тры дні (200 абаротаў у хвіліну, 75 ° C) папярэдняга культывавання Thiobacillus serrata праводзіліся ў асяроддзі 182 (DSMZ).
Узоры наначасціц золата былі падрыхтаваны метадам мицеллярной блок-супалімернай літаграфіі. Гэты працэс падрабязна апісаны ў гл. 60. Карацей кажучы, міцэлы, якія інкапсулююць іёны золата, былі сінтэзаваны шляхам змешвання супалімера з HAuCl4 у талуоле. Затым вычышчаныя покрыўныя шкла апускалі ў раствор і апрацоўвалі УФ-выпраменьваннем у прысутнасці аднаўляльніка для атрымання залатых насення. Нарэшце, залатыя насенне вырошчвалі шляхам кантакту покрыўнага шкла з водным растворам KAuCl4 і этаналаміну на працягу 16 хвілін, што прывяло да квазіперыядычнага і вельмі аднастайнага размяшчэння несферычных наначасціц золата ў блізкім інфрачырвоным дыяпазоне.
Каб пераўтварыць інтэрфераграмы ў выявы OT, мы выкарысталі самаробны алгарытм, падрабязна апісаны па спасылцы. 33 і даступны ў выглядзе пакета Matlab у наступным публічным рэпазітары: https://github.com/baffou/CGMprocess. Пакет можа разлічваць інтэнсіўнасць і OT выявы на аснове запісаных інтэрфераграм (уключаючы эталонныя выявы) і адлегласцей да сеткі камер.
Каб вылічыць фазавую схему, прымененую да SLM для атрымання зададзенага тэмпературнага профілю, мы выкарысталі раней распрацаваны самаробны алгарытм39,42, які даступны ў наступным публічным рэпазітары: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Уваходам з'яўляецца жаданае тэмпературнае поле, якое можа быць зададзена ў лічбавым выглядзе або з дапамогай манахромнага BMP-малюнка.
Каб сегментаваць клеткі і вымераць іх сухую вагу, мы выкарыстоўвалі наш алгарытм Matlab, апублікаваны ў наступным публічным сховішчы: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. На кожнай выяве карыстальнік павінен націснуць на цікавую бактэрыю або mCFU, наладзіць адчувальнасць палачкі і пацвердзіць выбар.
Для атрымання дадатковай інфармацыі аб дызайне даследавання глядзіце анатацыю да справаздачы аб даследаваннях прыроды, спасылка на якую спасылаецца на гэты артыкул.
Дадзеныя, якія пацвярджаюць вынікі гэтага даследавання, можна атрымаць у адпаведных аўтараў па абгрунтаваным запыце.
Зыходны код, выкарыстаны ў гэтым даследаванні, падрабязна апісаны ў раздзеле "Метады", а версіі для адладкі можна загрузіць з https://github.com/baffou/ у наступных рэпазітарах: SLM_temperatureShaping, CGMprocess і CGM_magicWandSegmentation.
Мехта, Р., Сінгхал, П., Сінгх, Х., Дамл, Д. і Шарма, А. К. Разуменне тэрмафілаў і іх шырокага спектру прымянення. Мехта, Р., Сінгхал, П., Сінгх, Х., Дамл, Д. і Шарма, А. К. Разуменне тэрмафілаў і іх шырокага спектру прымянення.Мехта, Р., Сінгхал, П., Сінгх, Х., Дамл, Д. і Шарма, А. К. Агляд тэрмафілаў і іх шырокае прымяненне. Мехта, Р., Сінгхал, П., Сінгх, Х., Дамл, Д. і Шарма, А.К. 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Мехта Р., Сінгхал П., Сінгх Х., Дамл Д. і Шарма А.К.Мехта Р., Сінгхал П., Сінгх Х., Дамл Д. і Шарма А. К. Глыбокае разуменне тэрмафілаў і шырокі спектр прымянення.3 Біятэхналогія 6, 81 (2016).
Час публікацыі: 26 верасня 2022 г